鹅掌楸属树种近交衰退分析1)

姚俊修 李火根 边黎明 施季森

(林木遗传与生物技术省部共建教育部重点实验室(南京林业大学)，南京，210037)

交配系统是影响群体遗传结构的主要因素［1］。异交是维持种内遗传变异的一个重要机制［2-3］;而近交则降低种内遗传变异，导致后代群体的遗传组成趋于纯合、遗传性状稳定，并使隐性基因得以表现而被淘汰［4-7］。近交导致子代适合度下降，如种子数量和质量下降、个体的生长发育不良等，呈现不同程度的近交衰退［8-10］。近交衰退是植物交配系统进化的主要选择压力之一，植物或者适应近交，或者通过形成避免发生近交机制来防止近交衰退［3］。

木兰科(Magnoliaceae)鹅掌楸属(Liriodendron)树种为珍贵用材与园林观赏兼用树种，现仅存2 个种，即鹅掌楸(L. chinense Sarg.)和北美鹅掌楸(L.tulipifera Linn.)，前者主要分布于我国长江以南及越南北部，后者分布于美国东部和加拿大东南部。由于自然与人为原因，导致鹅掌楸天然种群个体数目日益减少，种群间成岛状星散分布，彼此隔离，已列为我国二级濒危保护树种［11-12］。与大多数林木相似，自然情况下，鹅掌楸属树种以异交为主。近交物种遗传组成高度杂合，但同时也蕴含了较高的遗传负荷。随着鹅掌楸种群数目逐渐减少，种群内近交机率大大增加，势必增加有害基因纯合的概率，从而使鹅掌楸发生近交衰退，加剧其濒危程度。为分析鹅掌楸近交衰退表现，笔者拟利用交配设计，采用人工杂交获得不同交配类型组合子代(包括种间杂交、种内杂交、回交及自交)，通过比较不同交配类型子代的种子饱满度、出苗率、苗期生长量，以及SSR 纯合子比率等信息，从表型与基因型两方面分析鹅掌楸近交衰退状况，期望为鹅掌楸物种保护、杂交育种及种子园管理等方面提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

鹅掌楸交配亲本来自南京林业大学下蜀实习林场，其中，4 株鹅掌楸(编号:LS，WYS，FY 和SZ)、4株北美鹅掌楸(编号:MSL，BM，LYS 和NK)杂交亲本来自1993年定植的鹅掌楸种源试验林，该试验林具体情况可参考文献［13］。另一交配亲本杂交鹅掌楸(F1)选自1978年定植于该林场的杂种子代测定林，其母本为鹅掌楸，来自江西庐山;父本为定植于南京明孝陵的1 株北美鹅掌楸，20 世纪30年代引自美国。2007年5月，分别对这9 个杂交亲本用毛竹搭架，开展人工杂交试验，共26 个交配组合，其中，回交组合15 个，F1为母本有7 个组合:F1×LS、F1×MSL、F1×BM、F1×WYS、F1×LYS、F1×NK、F1×FY;F1为父本有8 个组合:LS×F1、MSL×F1、BM×F1、WYS×F1、LYS×F1、NK×F1、FY×F1、SZ×F1;种间交配组合4 个:LS×NK、LYS×LS、WYS×BM、BM×FY;种内交配组合4 个:LYS×MSL、BM×MSL、BM×NK、LYS×NK;自交组合3 个:SY×SY、MSL×MSL、LYS×LYS。

2007年10月采集上述交配组合种子，2008年3月播种于南京桥林林业科技有限公司苗圃，同年9月采集上述各组合子代幼苗叶片，每家系随机采取30 个个体(不足30 的全部取样)，每个体采集新鲜叶片2 ～4 片，放入冰箱中-70 ℃保存备用。2009年3月，对各交配组合子代在同一苗圃进行苗期试验，2009年12月，获得15 个回交组合(7 个正交组合，8个反交组合)，其中，一个自交组合MSL 获得子代数目较少，仅有8 株。共采集各类交配组合子代样本610 株。

为了检测近交组合子代的饱满度与出苗率，2008年5月开展第2 批杂交。选取2 株鹅掌楸(LS、WYS)及2 株北美鹅掌楸(MSL、BM)作母本，以LS、FY、SZ、F1、LYS、BM、WYS、MSL、NK 为父本，开展如表1的交配设计，于同年10月采集上述交配设计种子，12月在国家林业局南方林木种子检验中心测定种子饱满度，2009年3月在南京桥林林业科技有限公司苗圃进行场圃发芽率测定。

表1 鹅掌楸不同交配组合设计

1.2 试验方法

1.2.1 种子饱满度及出苗率测定

对表1中27 个不同交配组合子代种子应用X射线摄影检验技术进行饱满度检验，每组合每处理含100 粒种子，4 次重复，根据种子有无胚的影像进行饱满度的判断，统计饱满种子数。种子出苗率往往以发芽势为判断指标，指种子发芽初期在规定时间内能正常发芽的种子粒数占供检种子粒数的比例［14］。利用上述所得种子同时在相同立地条件下进行场圃出苗率测定。

1.2.2 苗期生长量测定

2009年12月，测量不同交配组合子代各单株的苗高(H)、地径(D)，苗高和地径均精确到0.01 cm，标准差与变异系数计算公式如下:①标准差(S)=式中:xi指第i 个个体的观察值，指样本平均值，n指样本数;②变异系数c=(s/)×100%。

1.2.3 近交衰退估算

种子饱满度、出苗率、苗期生长量3 个性状的近交衰退估算采用公式δ=1-Ws/Wo［15］，式中，Ws、Wo分别表示近交子代与异交子代的适合度。适合度有相对适合度与绝对适合度2 种，相对适合度是指某群体相对于特定基因型群体对子代的贡献率，通常以绝对适合度最高的基因型为参照［16］。

1.2.4 纯合子比率、基因杂合度及固定指数分析

利用12 对实验室自行开发的SSR 引物［17］对4株鹅掌楸及4 株北美鹅掌楸亲本基因杂合度及不同交配组合类型(种间杂交、种内杂交、回交、自交)子代进行PCR 检测，统计每一亲本及不同交配组合子代的纯合子数量，计算纯合子比率。其中杂合子比率(观测杂合度Ho)与纯合子比率之和为1。

固定指数F 是衡量配子间相关系数的指标，估算公式为F=1-H0/He［18］，式中Ho指观测杂合度，是实际观察到的杂合基因型个体所占的比率;He指期望杂合度，指随机交配情形下杂合子的期望频率。

1.2.5 统计分析

方差分析采用统计软件SAS6.12。

2 结果与分析

2.1 鹅掌楸不同交配组合/类型子代的饱满度及出苗率

对鹅掌楸不同交配组合饱满度及出苗率研究发现:不同回交组合种子饱满度变异较大，以F1×MSL最高，WYS×F1最低，二者相差13%。而相同亲本的正反交组合饱满度差异也较大，其中F1×WYS 与WYS×F1相差最大，为8.5%。回交中正交(F1为母本)组合平均为15.75%，反交组合平均为13.4%。可见，F1做母本种子饱满度比F1做父本要大，平均高2. 35% 。而4 个自交组合种子饱满度平均为3.88%。对出苗率分析发现:回交组合中MSL×F1出苗率最高，为10%，WYS×F1与F1×BM 出苗率均最低，为1.5%，二者相差8.5%。而相同亲本的正反交组合出苗率差异也较大，F1×WYS 与WYS×F1相差最大，为2.75%;正反交组合种子出苗率变异不大，正交组合平均为4.44%，反交组合平均为4.17%，二者仅相差0.27%;而4 个自交组合种子出苗率平均仅为0.25%。综上可见，近交造成子代饱满度及出苗率衰退严重，而种子饱满度及出苗率则与父母本基因型有关。

表2列出了鹅掌楸不同交配类型子代种子饱满度、出苗率及其标准差比较结果表明，种内交配子代种子饱满度与出苗率均最高，分别为27.54%、9.29%，饱满度高出种间杂交、回交、自交子代的33.30%、89.02%、610. 00%;而出苗率则高出80. 04%、116.00%、3 616.00%;不同交配类型子代种子饱满度与出苗率变异趋势是一致的，即:种内＞种间＞回交＞自交。

表2 鹅掌楸不同交配类型种子饱满度与出苗率 %

表3列出了鹅掌楸不同交配类型间及交配类型内组合间种子饱满度及出苗率方差分析结果，二者在重复间差异均不显著，而在交配类型间及交配类型内组合间二者差异均达到了极显著水平。

表3 鹅掌楸不同交配类型种子饱满度与出苗率方差分析结果

2.2 不同交配组合/交配类型子代的苗期生长量

对鹅掌楸近交子代苗期生长量研究发现，各交配组合在地径和苗高上均存在明显差异。对于地径生长:变异系数从LS×NK 的21.99%到BM×MSL 的60.87%，后者是前者的2.77 倍。在回交组合中，变异系数最大组合为BM×F1(58.77%)，最小组合为LS×F1(23.78%)，前者是后者2.47 倍。正反交组合中除F1与LS 组合外，其余正反交组合中反交组合变异系数均大于正交组合，相差最大的正反交组合为F1×FY(26.53%)、FY×F1(40.91%)，二者相差14.38%。对于苗高生长:变异系数从F1×MSL 的21. 00% 到BM×MSL的58. 22% ，后者是前者的2.77 倍。在回交组合中，变异系数最大组合为F1×NK(53.57%)，最小组合为F1×MSL(21.00%)，前者是后者2.55 倍。在正反交组合中，F1与LS、FY、MSL、LYS 回交组合中反交组合苗高变异系数高于正交组合，而F1与WYS、BM、NK 回交组合则相反(正交大于反交)，相差最大的正反交组合为F1×FY(28.48%)，FY×F1(44.85%)，二者相差16.37%;而自交组合地径与苗高均值均低于回交组合，可见近交衰退严重。

表4列出了鹅掌楸不同交配类型子代苗期生长量。由表4可看出，子代苗期生长在不同交配类型间差异较大，地径与苗高生长量由大到小顺序为:种间杂交、回交、种内杂交、自交。

表4 鹅掌楸不同交配类型子代苗期生长量比较

表5给出了不同交配类型子代苗期生长量的方差分析结果。苗高与地径在交配类型间差异极显著，同时，在交配类型内组合间差异也达极显著水平。

表5 鹅掌楸不同交配类型苗期生长性状方差分析结果

2.3 鹅掌楸近交组合子代的衰退表现

根据不同交配类型子代种子饱满度及出苗率结果(表2)，利用近交衰退估算公式可以得出，相对于种内交配，回交、自交组合子代种子饱满度近交衰退指数δ 分别为0.47、0.86;种子出苗率近交衰退指数δ 分别为0.54、0.97，近交组合平均饱满度与出苗率衰退指数均高于种间交配组合子代，近交衰退明显。值得注意的是，与种内杂交组合子代相比，种间杂交组合子代在饱满度与出苗率2 个表型上也有一定程度的降低，这可能是由于鹅掌楸2 个种由于长期的地理隔离导致一定程度的生殖隔离，进而在子代适合度上表现出较低水平的远交衰退。

根据不同交配组合苗期生长量分析结果(表4)，利用近交衰退估算公式可以得出，相对于种间杂交，种内杂交、回交及自交组合子代平均地径近交衰退指数δ 分别为0.48、0.16、0.49。平均苗高近交衰退指数δ 分别为0.32、0.27、0.35。自交组合平均地径与苗高衰退指数大于种内杂交子代，可见自交子代苗期生长量近交衰退明显。而回交组合子代地径与苗高衰退指数小于种内杂交子代，分析可能原因为本研究中的回交组合为三交种，并非真正意义上的回交，涉及2 个种之间的基因交流，而种内交配组合仅为单个种之间的基因交流。

2.4 不同交配类型子代的固定指数

由不同交配类型子代固定指数(表6)可以看出，不同交配类型子代固定指数均小于0，表明杂合子过量。鹅掌楸是一个高度杂合树种，具有虫媒异交特性，使其保持了较高的杂合度，这可能是本研究中使自交子代杂合子偏多的原因，从而导致固定指数F＜0。自交子代固定指数最高，为-0.136 5，种间杂交子代固定指数最低，为-0. 5558，二者相差0.419 3，不同交配类型子代含杂合子由高到低变异趋势为:种间杂交、种内杂交、回交、自交。

表6 鹅掌楸不同交配类型子代固定指数

2.5 不同交配组合/交配类型子代SSR 纯合子比率

对不同组合子代纯合子比率研究发现，不同组合子代纯合子比率差异较大，最大为MSL 自交组合(7 9. 1 7% )，最小为种间交配WYS×BM，仅为10.83%，二者相差68.34%。而不同回交子代中纯合子比率变异幅度也较大，F1×WYS 最大，为48.33%，F1×BM 最小，为17.50%，二者相差30.83%;而F1与鹅掌楸交配子代纯合子比率较F1与北美鹅掌楸交配子代有明显增大。正反交组合子代纯合子比率并不完全一致，其中F1×LS 与LS×F1相差最大，为7.50%，F1×NK 与NK×F1相差最小，为1.12%。

从不同交配类型子代纯合子比率可以看出，自交子代纯合子比率均值最高，为78.77%，种间杂交子代纯合子比率均值最低，为21.59%，二者相差57.18%，自交子代纯合子比率均值分别高出种内杂交、回交、种间杂交子代的1.04、1.35、2.65 倍;不同交配类型子代纯合子比率均值由高到低变异趋势为:自交、种内杂交、回交、种间杂交。

表7 鹅掌楸不同交配类型子代的纯合子比率 %

表8列出了鹅掌楸不同交配类型子代纯合子比率的方差分析结果。在4 种交配类型间，各交配类型组合间以及不同位点间的纯合子比率差异均达极显著水平，说明不同交配类型子代的纯合子比率差异显著。

表8 鹅掌楸不同交配类型子代纯合子比率方差分析结果

2.6 鹅掌楸、北美鹅掌楸交配亲本的基因杂合度

通过对4 个鹅掌楸及4 个北美鹅掌楸亲本在12 个不同位点观测基因杂合度研究发现:LYS、NK、MSL、BM、FY、WYS、SZ、LS 亲本基因杂合度分别为58.33%、41.67%、33.33%、25.00%、25.00%、25.00%、25.00%、16.67%，据此推算4 个北美鹅掌楸亲本(LYS、NK、MSL、BM)基因杂合度平均为39.58%;4 个鹅掌楸亲本(FY、WYS、SZ、LS)基因杂合度平均为22.92%，北美鹅掌楸基因杂合度平均高出鹅掌楸16.7%。

3 结论与讨论

3.1 植物近交衰退的度量

近交衰退既可以从表型上检测，也可以从基因型水平来分析。植物近交衰退的表型检测多采用与适合度有关的性状，如开花数量、结实率、种子大小、饱满度、发芽率、生长量(株高、胸径及体积)等［19］，也有采用生理生化指标(如光合作用参数)来检测［20］。从基因型水平，一般采用基因组信息的电泳数据来间接测定［3］，如用固定指数F 来度量近交程度。

度量近交衰退程度的参数主要有近交衰退系数δ、累计成活率Vi及致死当量α 等。近交衰退系数δ实际为相对适合度，通常被定义为1 减去近交子代相对于异交子代的适合度，即:δ=1-Ws/Wo，该方法能够较方便地测定种群的近交衰退，是目前最常用的度量近交衰退的参数［15］。累计成活率Vi利用种子出苗率(Vg)、苗期成活率(Vs)及胚的存活率(Ve种子数与初始胚的数量的比值)来度量近交衰退，即Vi=Ve×Vg×Vs［21］，若异交子代总体均值显著大于自交子代，则该群体近交衰退明显。此外，近交衰退也可用纯合致死等位基因的数量即致死当量α 来度量，即α=-4lnR［22］，其中R 表示自交子代相对于异交子代的相对适合度，致死当量在不同物种及个体间变化很大，在农作物及动物间变化范围分别为1.2 ～5.2，1.0 ～4.0，而在林木中致死当量往往大于5.0，这可能与林木为高度异交物种，基因高度杂合，蕴含了大量隐性不利基因有关。

3.2 鹅掌楸、北美鹅掌楸亲本杂合度

在群体遗传学研究中，基因杂合度是衡量群体遗传变异的一个重要指标［23］，在个体数有限的小群体内，随着世代繁育，势必增加近交的几率，导致群体基因杂合度下降，遗传变异或遗传多样性降低，从而造成近交衰退的发生［24］。本研究对鹅掌楸(LS、FY、SZ、WYS)、北美鹅掌楸(LYS、MSL、BM、NK)亲本在12 个不同位点的基因杂合度进行了定量估算，发现北美鹅掌楸杂合度(3 9. 5 8% )高于鹅掌楸(22.92%)，可能的解释为，与鹅掌楸相比，北美鹅掌楸种群规模大、分布范围广、近交几率相对较低。本研究结果仅对来自鹅掌楸、北美鹅掌楸各4 个亲本进行比较分析，数量偏少。因此，下一步笔者将增加亲本及交配组合子代数量，对此作进一步验证。

3.3 鹅掌楸近交衰退状况及涵义

在现存的鹅掌楸种群中，大部分个体数量很少。贺善安等在对长江流域以南亚热带广袤地域内84个鹅掌楸分布点研究发现，个体数在1 ～20 株的分布点有60 个，百株以上的分布点仅5 个［25］。从鹅掌楸天然分布(呈岛状星散分布)形式来看，鹅掌楸正处在被分割、隔离及孤立的状态，其基因交流会进一步受到阻碍，遗传多样性也会进一步降低;天然群体的更新能力也较差，整个物种处于濒危状态。另有研究发现，鹅掌楸天然群体种子发芽率极低，一般都在5%以下，有的甚至不到1%，造成这种情况的直接原因可能与种群规模过小，授粉条件差有关［26］24。从遗传学的角度看，小种群间基因交流受阻势必会造成种内近交的发生从而出现近交衰退现象。本研究发现自交子代出苗率平均为0.25%;近交衰退指数δ 为0.97，这意味着自交子代适合度接近于0，可见近交衰退严重。研究还发现种间交配组合子代饱满度与出苗率均低于种内组合，原因可能是种间组合亲本间存在生殖隔离而使其杂交亲和度下降所致;而对苗期生长量的研究发现，近交子代(回交)近交衰退表现不明显，这可能与试验期短有关，也可能是由于自然选择的作用使有害基因淘汰的结果［27］，即自然选择的作用有利于保存那些使生物有较强适应能力的基因。

对于现有的鹅掌楸天然群体，当前急需采取措施避免现有种群发生严重的近交衰退。如禁止盗伐，防止其种群规模进一步缩小;同时，可考虑引入新的种质，扩大种群规模，促使种群间基因交流与重组［26］24-25;也可在母树树冠下方或周围，在种子散落前进行局部杂灌清理，以促进鹅掌楸自然更新。或者采用迁地保护措施，有计划地在天然群体中采集优良单株的穗条进行嫁接，建立种质资源库。

此外，基于鹅掌楸近交衰退严重，因此，在鹅掌楸杂交育种及杂种优势利用时，应尽可能避免利用F1代的回交子代。

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