包埋-交联磷脂酶A1聚集体的制备及酶学性质

王 妍，王 雪，李 越，李志平，于殿宇*

(东北农业大学食品学院，黑龙江 哈尔滨 150030)

包埋-交联磷脂酶A1聚集体的制备及酶学性质

王 妍，王 雪，李 越，李志平，于殿宇*

(东北农业大学食品学院，黑龙江 哈尔滨 150030)

为得到可重复使用且活力较高的固定化磷脂酶A1，采用包埋-交联酶聚集体的方法对磷脂酶A1进行固定，对固定化条件和部分酶学特性进行优化和研究，确定最佳条件为：酶液质量浓度0.06g/mL、沉淀剂饱和度80%、沉淀pH6、沉淀时间35min、戊二醛体积分数0.4%、交联时间6.5h、海藻酸钠质量分数2%、Ca2+浓度0.25mol/L。得到包埋-交联磷脂酶聚集体A1的酶活回收率为80.2%。固定化酶热稳定性增强，重复使用7次相对酶活力保留在65%以上。

磷脂酶A1；沉淀剂；戊二醛；交联酶聚集体；固定化；包埋；扫描电镜(SEM)

磷脂酶A1在磷脂改性、油脂精炼等方面有广泛应用，但游离磷脂酶A1价格昂贵，且不易回收，催化水解时条件苛刻；与游离酶相比，固定化酶在保持其高效、专一及温和的酶催化反应特性时，还呈现贮存稳定性高、分离回收容易、可多次重复使用、操作连续可控、工艺简便等优点[1]。

交联酶聚集体(cross-linked enzyme aggregates，CLEAs)[2-5]是一类新型的固定化酶技术，具有制备简单、酶活回收率高、操作和保存稳定性强等优点，被广泛运用于固定化酶的制备中。近年来，CLEAs技术与材料学、印迹工程、介质工程、反应工程学等相结合取得了一系列新进展，包括载体固定化CLEAs[6]、包埋CLEAs、印迹法CLEAs[7]、多酶CLEAs、CLEAs膜浆反应器等，在手性分子拆分与合成、抗生素生产等领域取得了一些成果[8-10]。有些酶的CLEAs相对游离酶的酶活回收率竟超过100%[11]，某些脂酶的交联酶聚集体活性甚至可提高10倍以上[12]；有些酶的CLEAs对耐热性、稳定性、对抗血清蛋白水解酶的能力上比游离酶有更高的稳定性[13]。但是由于其不易回收等缺点，使酶的重复利用率降低，因此为得到活力高且回收率高的固定化酶，本实验在交联酶聚集体技术基础上进行改进，先将游离磷脂酶A1制成交联酶聚集体，再将得到交联酶聚集体进行包埋，得到固定化磷脂酶A1。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

磷脂酶A1丹麦诺维信公司；无水乙醇、磷酸二氢钠、柠檬酸、海藻酸钠、戊二醛、考马斯亮蓝、氢氧化钠均为分析纯。

722E型分光光度计 上海光谱仪器有限公司；电子微量天平 梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；PHS-3C型pH计 上海伟业仪器厂；79-2双向磁力加热搅拌器上海卓康生物科技有限公司；LGJ-1型冷冻干燥机 上海医用分析仪器厂；S-3400N型扫描电镜 日本Hitachi公司。

1.2 方法

1.2.1 磷脂酶A1聚集体的制备

将1mL磷脂酶A1(游离酶活力：实测为3500U/g加入到一定量pH值为6.0的磷酸二氢钠与柠檬酸缓冲液中(0.2mol/L磷酸二氢钠溶液、0.1mol/L柠檬酸溶液)，将无水乙醇作为沉淀剂，在0℃条件下缓慢加入其中并持续搅拌，以保证酶聚集体颗粒均匀。冰浴反应一段时间，然后于10000r/min离心30min，收集沉淀。

1.2.2 包埋-交联磷脂酶A1聚集体的制备

将聚集体加入到一定体积分数的戊二醛溶液中，搅拌反应一段时间，离心去除上清液，用缓冲液冲洗交联酶聚集体数次，直到洗液中检测不到任何的活力，收集沉淀用磷酸盐缓冲液悬浮。在20mL一定质量分数的海藻酸钠溶液中加入酶聚集体1mL，搅拌均匀。静置一段时间后，用灭菌后的5mL注射器吸入上述混合液，以约5滴/s的速度注入于一定浓度CaCl2溶液中制成微胶囊，将形成的微胶囊在4℃的CaCl2溶液中放置一段时间使其进一步硬化。然后抽滤得到硬化的微胶囊，用无菌生理盐水洗涤3～5次，以洗去表面的CaCl2，再进行冷冻干燥备用。

1.2.3 交联磷脂酶A1聚集体的制备及包埋条件的正交试验

在单因素试验基础上，选用L9(34)正交表进行交联磷脂酶A1聚集体的制备及包埋条件的正交试验研究，以酶活回收率为指标，确定最佳戊二醛体积分数、交联时间、海藻酸钠质量分数及Ca2+浓度4个反应条件，以得到酶活回收率更高的固定化磷脂酶。试验方案见表1。

表1 正交试验因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal tests

1.2.4 游离磷脂酶酶活力测定

参照文献[14]方法测定。

1.2.5 固定化磷脂酶酶活力测定

称取一定质量的经干燥后的固定化酶，经复水后，按照游离磷脂酶活力测定的方法进行相应的测定。

1.2.6 蛋白质含量测定

采用考马斯亮蓝染色法[15]测定。

1.2.7 蛋白质沉淀率测定

式中：a1为固定化后酶液剩余蛋白质含量；a2为固定化前酶液的蛋白质含量。

1.2.8 固定化酶酶活回收率的计算

1.2.9 固定化酶酶学性质研究

1.2.9.1 最适温度

在酶液质量浓度0.006g/mL、沉淀剂饱和度80%、沉淀pH6、沉淀时间35min、戊二醛体积分数0.4%、交联时间6.5h、海藻酸钠质量分数2%、Ca2+浓度0.25mol/L的条件下固定酶和游离酶，在40～65℃范围内每隔5℃测定固定化酶和游离酶的相对酶活力。

1.2.9.2 最适pH值

以50mL、5%粉末磷脂溶液为底物，在50℃条件下，进行酶解反应，在pH4.3～6.8范围内测定游离酶和固定化酶的相对酶活力。

1.2.9.3 操作稳定性

以50mL、5%粉末磷脂溶液为底物，在50℃、pH4.8条件下进行酶解反应，分别在相同条件下连续进行7批次操作，测定其酶活力，以第一批次酶活力作为100%计算相对酶活力。

1.2.10 固定化酶结构与表征研究

采用扫描电镜对固定化酶样品进行扫描。

2 结果与分析

2.1 磷脂酶A1聚集体的制备

2.1.1 磷脂酶溶液质量浓度的确定

在沉淀剂饱和度为70%、沉淀pH值为5、沉淀时间为25min的条件下，选择不同质量浓度的磷脂酶液进行沉淀聚集，考察其对酶活回收率的变化规律，结果见图1。

图1 磷脂酶液质量浓度对聚集体活性的影响Fig.1 Effect of free enzyme concentration on the activity of PLA aggregate

由图1可知，酶活回收率随着游离酶添加量的增加逐渐增大，但当酶添加量大于0.06g/mL时随着酶添加量的增加活力逐渐降低，所以选择酶添加量为0.06g/mL。

2.1.2 沉淀剂饱和度的确定

在磷脂酶溶液质量浓度为0.06g/mL、沉淀pH值为5、沉淀时间为25min的条件下，选择不同饱和度的无水乙醇对磷脂酶进行沉淀，考察其对蛋白质沉淀率和酶活回收率的变化规律，结果见图2。

图2 沉淀剂饱和度对磷脂酶聚集体活性的影响Fig.2 Effect of precipitant saturation degree on the activity of PLA aggregate

由图2可知，随着沉淀剂饱和度的增加，酶聚集体活力和蛋白质沉淀率都呈现先增高后降低的趋势，当饱和度为75%时，酶聚集体活力最高。但此时蛋白质沉淀率损失较多，当饱和度为80%时，蛋白质沉淀率达到90%以上。综合来看，选择沉淀剂饱和度为80%最佳。

2.1.3 沉淀pH值的确定

在磷脂酶溶液质量浓度为0.06g/mL、沉淀饱和度为80%、沉淀时间为25min的条件下，选择不同pH值对磷脂酶进行沉淀，考察其对蛋白质沉淀率和酶活回收率的变化规律，结果见图3。

图3 沉淀pH值对磷脂酶聚集体活性的影响Fig.3 Effect of pH on the activity of PLA aggregate

由图3可知，当pH值为7时，蛋白质沉淀率最高，但此时相对酶活力损失较多；当pH值为5时，酶聚集体相对活力最高，但此时蛋白质沉淀率损失较多。综合来看，pH值为6时蛋白质沉淀率和酶聚集体相对活力都在90%以上，所以选择pH值为6最佳。

2.1.4 沉淀时间的确定

在磷脂酶溶液质量浓度为0.06g/mL、沉淀饱和度为80%、沉淀pH值为6的条件下，选择不同沉淀时间来制备磷脂酶聚集体，考察其对酶活回收率的变化规律，结果见图4。

图4 沉淀时间对磷脂酶聚集体活性的影响Fig.4 Effect of precipitation time on the activity of PLA aggregate

由图4可知，酶活回收率随着沉淀时间的增加而逐渐增大，在沉淀35min时，酶活回收率达到最大值，而后随着沉淀时间的增加而降低。因此选择沉淀时间为35min最佳。

2.2 交联磷脂酶A1聚集体的制备及包埋条件的确定2.2.1戊二醛体积分数的确定

在交联时间为4.5h、海藻酸钠质量分数为2%、Ca2+浓度为0.2mol/L的条件下，以戊二醛作为交联剂，考察不同体积分数交联剂对酶活回收率的影响，结果见图5。

图5 戊二醛体积分数对磷脂酶固定化的影响Fig.5 Effect of glutaraldehyde concentration on the activity of immobilized PLA

由图5可知，随着戊二醛体积分数增加，固定化酶酶活回收率先增加后降低，这是因为戊二醛体积分数增加时，戊二醛和磷脂酶发生交联反应，酶流失减少，酶活回收率也随着增加，但进一步增加戊二醛体积分数将导致酶活力下降，主要因为酶分子活性基团被戊二醛过多的修饰，导致酶活力降低。所以选择戊二醛的体积分数为0.3%。

2.2.2 交联时间的确定

在戊二醛体积分数为0.3%、海藻酸钠质量分数为2%、Ca2+浓度为0.2mol/L的条件下，考察不同固定时间对酶活回收率的影响，结果见图6。

图6 交联时间对磷脂酶固定化的影响Fig.6 Effect of cross-linking time on the immobilization of PLA

由图6可知，开始固定化时，由于包埋逐渐紧密，流失减少，固定化酶活回收率呈升高趋势；6.5h时固定化酶活达到最大，再延长时间只会使Ca2+与酶作用，降低活性，因此6.5h为最佳固定化时间。

2.2.3 海藻酸钠质量分数的确定

在戊二醛体积分数为0.3%、交联时间为6.5h、Ca2+浓度为0.2mol/L的条件下，选择不同质量分数的海藻酸钠溶液对磷脂酶聚集体进行包埋，考察不同质量分数海藻酸钠溶液对固定化酶活回收率的影响，结果见图7。海藻酸钠质量分数为2%时，酶活回收率最高，随着质量分数增加固定化酶活力降低。这是因为，随着海藻酸钠质量分数增加，微胶囊的强度增加，但在反应过程中底物扩散更加困难，因此表现为固定化酶活力降低。所以选择海藻酸钠质量分数为2%。 2.2.4Ca2+浓度的确定

图7 海藻酸钠质量分数对磷脂酶固定化的影响Fig.7 Effect of sodium alginate concentration on activity of immobilized PLA

在戊二醛体积分数为0.3%、交联时间为6.5h、海藻酸钠质量分数为2%的条件下，选择不同Ca2+浓度的CaCl2溶液进行固定化，考察不同Ca2+浓度对固定化酶酶活回收率的影响，结果见图8。

图8 Ca2+浓度对磷脂酶固定化的影响Fig.8 Effect of Ca2+concentration on activity of immobilized PLA

由图8可知，随着Ca2+浓度增加，固定化酶活回收率增加。这是由于海藻酸盐很容易与Ca2+作用，形成热不可逆凝胶，可将酶固定化在凝胶网络中，凝胶强度与Ca2+浓度成正比[16]，但是Ca2+浓度过高时会与酶作用而使酶变性失活，因此，Ca2+浓度选择在0.25mol/L为最佳。

2.3 正交试验优化交联磷脂酶A1聚集体的制备及包埋条件结果

由表2可知，4个因素对酶活回收率的影响大小依次为C＞B＞D＞A，即海藻酸钠质量分数＞交联时间＞Ca2+浓度＞戊二醛体积分数；最佳制备条件A3B2C2D2，在此条件下经验证得到酶活回收率为80.2%，高于正交试验中第2组试验值79.8%。所以，交联磷脂酶聚集体A1的最佳包埋条件为：戊二醛体积分数0.4%、交联时间6.5h、海藻酸钠质量分数2%、Ca2+浓度0.25mol/L。在该条件下，其酶活回收率为80.2%。

表2 正交试验优化交联磷脂酶A1聚集体的包埋条件结果Table 2 Results of orthogonal tests

2.4 固定化酶的酶学性质

2.4.1 最适温度

图9 温度对固定化酶相对酶活力的影响Fig.9 Effects of temperature on relative activity of immobilized phospholipase and free phospholipase

由图9可知，游离酶在50℃时相对酶活力最高，而固定化酶在60℃相对酶活力最高，可见固定化酶的耐热性优于游离酶。

2.4.2 最适pH值

图10 pH值对固定化酶相对酶活力的影响Fig.10 Effect of pH on relative activity of immobilized phospholipase and free phospholipase

由图10可知，游离酶的最适pH值为4.8，而固定化酶的最适pH值为5.8，显示固定化酶比游离酶较耐碱，有更宽泛的适应性。

2.4.3 固定化酶的操作稳定性

图11 重复使用次数对固定化酶相对酶活力的影响Fig.11 Effect of repeated use frequency on relative activity of immobilized lipase

由图11可知，固定化酶具有良好的操作稳定性，在连续使用7个批次后其相对酶活力仍保持65%以上。相对酶活力的下降可能是由于在不断搅拌下，固定化载体持水性发生变化，固定化酶凝胶结构的改变和酶的泄漏所造成的结果。

2.5 包埋-交联磷脂酶A1聚集体的SEM图像

图12 包埋-交联磷脂酶A1聚集体的SEM图像Fig.12 SEM images of encapsulation crosslinked phospholipase A1

图12 中a、b分别为海藻酸钠包埋的微胶囊冷冻干燥后颗粒的扫描电子显微镜(SEM)图片。由图12a可知，微球微表面形成致密的复合膜。因此，它能有效的防止磷脂酶从微胶囊中泄漏，而提高固定化酶的活力回收率。从图12b中可观察到，海藻酸钠微胶囊为材料内部具有规则蜂窝状通孔结构，孔径都在几微米以下，因而，其具有很大的内表面积，能有效包埋、截留磷脂酶，并且这也有利于底物和产物的扩散。这种多孔的形成，主要是因冷冻干燥，使冰晶升华而形成蜂窝状通孔结构，这种结构有很大的内表面积，可增加酶的包埋效率，提高磷脂酶与磷脂接触的界面面积，同时，减小底物和产物在微胶囊内部的扩散阻力，提高反应速度。

3 结 论

3.1 酶聚集体包埋-交联固定化磷脂酶A1，提高了单一法所带来的固定不稳定及酶活回收率低等缺点，酶聚集体包埋-交联最佳工艺条件为：酶液质量浓度0.06g/mL、沉淀剂饱和度80%、沉淀pH6、沉淀时间35min、戊二醛体积分数为0.4%、交联时间6.5h、海藻酸钠质量分数为2%、Ca2+浓度0.25mol/L。得到包埋-交联磷脂酶聚集体A1的酶活回收率为80.2%。

3.2 SEM结果显示：海藻酸钠包埋后的微球内部具有规则通孔结构，孔径较小，在几微米以下，具有很大的内表面积，能有效地包埋、截留磷脂酶，并且这也有利于底物和产物的扩散，固定化酶活力回收率较高。

[1]陶明, 张丽霞, 单良. 有机改性凹凸棒土交联吸附法固定化磷脂酶A1的研究[J]. 粮食与油脂, 2009(11): 12-15.

[2]武仙山, 何立千, 叶磊. 交联酶聚集体: 一种无载体酶固定化方法[J].生物技术, 2005, 15(2): 90-92.

[3]CAO Linqiu, van RANTWIJK F, SHELDON R A. Cross-linked enzyme aggregates: a simple and effective method for the immobilization of penicillin acylase[J]. Organic Letters, 2000, 2(10): 1361-1364.

[4]LOPEZ-SERRANO P, CAO Linqiu, van RANTWIJK F, et al. Crosslinked enzyme aggregates with enhanced activity: application to lipases [J]. Biotechnology Letters, 2002, 24(16): 1379-1383.

[5]薛建跃. 酶固定化及应用研究进展[J]. 巢湖学院学报, 2010, 12(6): 82-88.

[6]KIM J, LEE J, NA H B, et al. A magnetically separable, highly stable enzyme system based on nanocomposites of enzymes and magnetic nanoparticles shipped in hierarchically ordered, mesocellular, mesoporous silica[J]. Small, 2005, 1(12): 1203-1207.

[7]曹林秋. 载体固定化酶原理、应用和设计[M]. 北京: 化学工业出版社, 2008.

[8]van PELT S, QUIGNARD S, KUBAC D, et al. Nitrile hydratase CLEAs: the immobilization and stabilization of an industrially important enzyme [J]. Green Chemistry, 2008, 10(4): 395-400.

[9]KAUL P, STOLZ A, BANERJEE U C. Cross-linked amorphous nitrilase aggregates for enantioselective nitrile hydrolysis[J]. Advanced Synthesis & Catalysis, 2007, 349(13): 2167-2176.

[10]王梦凡, 齐崴, 苏荣欣, 等. 交联酶聚体技术研究进展[J]. 化学进展, 2010, 22(1): 173-178.

[11]SCHOEVAART R , WOLBERS M W, GOLUBOVIC M, et al. Preparation optimization and structures of cross-linked enzyme aggregates (CLEAs)[J]. Biotechnology and Bioengineering, 2004, 87(6): 754-762.

[12]CAO I, LANGEN L V, SHELDON R A. Immobilized enzymes: carrierbound or carrier-free[J]. Curr Opin Biotechnol, 2003, 14(4): 387-394.

[13]王惠, 吴兆亮, 童应凯, 等. 应用二次回归正交旋转组合设计优化黄霉素发酵培养基[J]. 食品研究与开发, 2006, 27(6): 19-22.

[14]李脉, 杨继国, 杨博. 磷脂酶A1酶活测定方法的研究[J]. 现代食品科技, 2007, 23(8): 80-82.

[15]OGINO C, NEGI Y, MATSUMIYA T, et al. Purification characterization and cequene determination of phospholipase D secreted by streptoverticillium cinnamoneum[J]. Biochem, 1995, 125(2): 263-269.

[16]孙万成, 将笃孝, 罗毅皓. 壳聚糖/海藻酸钠微胶囊固定化磷脂酶A1及其结构考察[J]. 食品科学, 2005, 26(9): 100-103.

Preparation of Encapsulation-crosslinked Aggregates of Phospholipase A1

WANG Yan，WANG Xue，LI Yue，LI Zhi-ping，YU Dian-yu*
(College of Food Science, Northeast Agricultual University, Harbin 150030, China)

In order to prepare reusable immobilized phospholipase A1 with high activity, the encapsulation-crosslinked aggregate method was used. The immobilization conditions and partial properties of immobilized phospholipase were determined. Results indicated that the optimal preparation conditions were enzyme concentration of 0.06 g/mL, precipitant saturation degree of 80%, precipitation time of 35 min, glutaradehyde concentration of 0.4%, cross-linking time of 6.5 h, sodium alginate concentration of 0.2% and Ca2+concentration of 0.25 mol/L. Under the optimal preparation conditions, the recovery rate of enzyme activity was 80.2%. The thermal stability of immobilized phospholipase was better than that of free phospholipase. Meanwhile, after seventh repeated use, the relative activity of immobilized phospholipase still remained more than 65%.

phospholipase A1；precipitan；glutaraldehyde；cross-linked enzyme aggregates (CLEAs)；immobilization；encapsulation；SEM

Q814.2

A

1002-6630(2012)05-0118-06