畜产品中四环素类抗生素残留的检测技术

刘 博，曹小妹，宋合兴，尹 航，高文惠

（河北科技大学生物科学与工程学院，石家庄 050018）

由于在饲养过程中兽药及饲料添加剂的大量使用而造成畜产品中药物残留，尤其是抗生素的残留，对人体的影响很大。研究发现，残留的抗生素对敏感的人能产生过敏反应；有些导致人的再生障碍性贫血；甚至导致人体产生耐药性，引起食源性感染和二重感染，造成中毒反应、致畸和致残等一系列危害。

畜产品中常见的抗生素有四环素类、青霉素类等。四环素类抗生素（TCs）是由链霉菌产生的一类广谱抗生素，主要有四环素（TC）、金霉素（CTC）、土霉素（OTC）、多西环素（DOTC）和美他环素（METC）等。四环族抗生素属快效抑菌剂，其作用机制主要为抑制细菌肽链的增长和蛋白质的合成，并能引起细菌细胞膜通透性改变，从而抑制DNA复制。四环族抗生素的抗菌谱很广，除对金黄色葡萄球菌、链球菌、肺炎球菌等革兰阳性菌及肠球菌、淋球菌等革兰氏阴性菌敏感外，对立克次体、支原体、衣原体属等非典型致病菌也有较好的抑菌作用[1]。

四环素类抗生素常用的是土霉素、四环素、金霉素、强力霉素等，因其价格便宜、抗菌谱广、抗菌力强、除被作为饲料添加剂以维持畜禽的健康并加速其生长外，还被广泛应用于动物各种传染性疾病的预防和治疗。美国FDA规定四环素在猪肉中的残留量应＜80 μg·kg-1；国际卫生组织和欧盟规定四环素在猪肉中的最大残留量应≤100 μg·kg-1；我国在无公害畜禽肉安全要求中规定的最高限量为100 μg·kg-1[2]。畜产品的四环素类抗生素残留，已经对人类健康构成潜在危害。因此，人们也在不断地对四环素类抗生素的检测技术进行研究和探索。本文总结了畜产品中残留的四环素类抗生素常规检测方法及新探索的方法。

1 微生物方法

微生物检测法是应用最早的方法，其测定原理是根据抗生素对微生物的生理机能、代谢的抑制作用来定性或定量确定样品中抗微生物药物残留，如纸片法（PD）、抑制法（TTC）。PD法是当样品中存在抑菌物质时，在纸片周围形成一个清晰的抑菌圈，在检测过程中培养基内加入溴甲酚紫指示剂，则形成浅蓝色的抑菌圈。TTC法即国标嗜热链球菌抑制法，其原理是1，2，3，5-氯化三苯四氮唑（TTC）会与活菌体内的琥珀酸脱氢酶反应，生成红色的代谢产物。将液体乳高温杀菌后添加嗜热链球菌菌液，37℃培养一段时间后加入TTC进行显色。若该液体乳样品中不含抗生素或含量低于检测限，嗜热链球菌会继续增殖将还原并产生红色物质（阴性结果）；相反，若样品中含有高于检测限的抗生素，则菌体生长受到抑制，指示剂TTC不能被还原，检测试管将保持其液体乳原有的白色（阳性结果）。TTC法是较早用于液体乳中抗生素残留定性检测的方法，也是我国实验室里普遍使用的方法。其成本低廉、操作简单，但由于需要增菌步骤，需要长时间才能完成检测。对于四环素族的抗生素，该方法的检出限为100 μg·mL-1。黄晓蓉等介绍了一种同时使用藤黄微球菌、枯草芽胞杆菌、蜡样芽胞杆菌蕈状变种为敏感菌，一次操作可同时检测在肉类、水产品及蛋中的4大类抗生素残留的微生物抑制方法，该方法四环素类的测定低限为0.1 mg·kg-1[2]。

2 薄层色谱法

薄层色谱法（TLC法）经常作为样品筛选方法，其优点是速度快，可以同时在多快板上点样，处理大批量样品的时间短，溶剂用量少，不需要复杂的仪器，有利于现场用，但仍需要复杂的样品前处理，且灵感度不高，不易定量，重现性不好。该方法一般使用硅胶板，用混合溶剂作展开剂，晾干后用一定的显色剂喷雾显色（显色可采用生物自显影法和化学法），用紫外检测器（UVD）或串联荧光检测器（FLD）检测。薄层色谱法检测已用于肌肉组织和蜂蜜中的四环素检测[3]。

3 分光光度法

分光光度法的原理是利用四环素本身在紫外区有很强的吸收，在一定的pH条件下，通过测定其吸光度而定量测定其含量；利用四环素与一些过渡性金属离子发生反应，生成有颜色的络合物，四环素与受电子体物质苯醌类物质发生荷移反应，生成荷移络合物，根据四环素的吸收光谱发生变化从而定量测定[4]。倪永年等运用动力学分光光度法测得四环素的线性范围为0.5～7.5 mg·L-1，检测限为0.23 mg·L-1[5]。

3.1 紫外光谱法

紫外光谱法具有快速、简便、易于操作、设备简单、造价低等特点，非常适合抗生素的快速检测。田益玲等将鲜乳用乙腈沉淀法去除乳蛋白后，在278 nm下测得其吸光度，然后根据工作曲线计算得到四环素的线性范围为0.03～115.0 mg·L-1，检出限为0.003 mg·L-1，相对标准偏差（RSD）为1.05%，该法与国标TTC法相比检出限低两个数量级。

3.2 荧光-紫外结合的分光光度法

荧光-紫外结合的分光光度法方法简便、分析精度高，但灵敏度不高。荧光法灵敏度高，但四环素类抗生素属于弱荧光物质，不能在荧光计上直接检测。高红等提出一种新的两者结合的测定四环素类抗生素的方法，运用该技术实现了在荧光计上直接检测四环素类抗生素，测得四环素类抗生素的线性范围均为0.10～9.00 μg·mL-1，四环素、土霉素、金霉素和多西环素的检测限分别为0.065、0.067、0.068和0.070 μg·mL-1[6]。另外，测定四环素的还有溴化十六烷基三甲基铵荧光法，其检测下限为 0.001 μg·mL-1，线性范围 0.01～12.0 μg·mL-1[7]。荧光法在测定牛奶中四环素也有应用[8]。

4 流动注射化学发光法

化学发光法的原理是四环素在碱性或酸性条件下可以降解，其降解产物可以和一些氧化剂如铁氰化钾、过氧化氢等发生反应而产生化学发光，另外一些金属离子如Cu2+等可以催化该化学发光反应。流动注射化学发光分析法具有灵敏度高、线性范围宽（一般可检测到μg·kg-1甚至ng·kg-1级，线性范围可达10-4数量级），重现性好，样品处理及仪器操作简单等优点，而被广泛用于药物的直接测定，也可实现四环素残留量的快速测定。但是由于化学发光分析选择性差、干扰因素多而限制了其使用，只要对这方面深入的研究以及不断排除干扰因素，将有望成为测定四环素残留量的较好方法。

贾宝秀等根据在酸性介质中，高锰酸钾能氧化四环素产生化学发光，甲醛能显著增强该体系的发光强度而建立了一种简单快速检测四环素的流动注射化学发光新方法，在最佳试验条件下，测定四环素的线性范围为0～60.0 μg·mL-1，检出限为 0.28 μg·mL-1，对 20.0 μg·mL-1四环素标准液进行11次平行测定，其相对标准偏差为1.3%[9]。

5 高效液相色谱法

高效液相色谱法（HPLC）法是用高压流动相的驱动使样品通过高性能层析柱，从而使样品中的抗生素得到高效率分离。因其具有高性能的检测设备和先进的操作控制系统，而确保了该方法有很高的灵敏度、自动化程度高、结果重复性好，进而使得HPLC成为目前检测抗生素残留广泛应用的一种方法。高效液相色谱法广泛应用于畜禽肉、牛奶、动物组织等的四环素检测。

5.1 高效液相色谱测定的样品前处理方法

高效液相色谱常用的样品前处理方法有固相萃取、凝胶渗透色谱净化、基体分散固相萃取[10]。农以宁等用比表面积较大，具有较强吸附能力的多壁碳纳米管的固相萃取-高效液相色谱（SPE-HPLC）方法同时测定了猪肉中四环素族，采用Oasis HLB固相萃取柱净化萃取，Diamonsil TM C18色谱柱分离，磷酸盐缓冲液（pH至2.5）-乙腈梯度洗脱，检测波长245 nm，结果表明，土霉素、四环索、金霉素测定的线性范围均为2～12 μg·mL-1，基底加标回收率为93.6%～96.1%[11]。多壁碳纳米管在固相萃取领域会有很好的发展前景。凝胶渗透色谱（GPC）方法是一种主要基于分子大小的原理进行分离样品的净化技术，其具有重现性好回收率高，适用于多残留分析等特点。谢维平等利用凝胶渗透色谱净化-高效液相色谱法同时测定了动物源性食品中四环素、土霉素、金霉素药物的残留，检测限为11～33 μg·kg-1，平均加标回收率为51.9%～95.2%，相对标准偏差3.4%～6.7%[12]。

5.2 高效液相色谱的检测器

高效液相色谱常见的检测器有荧光检测器、二极管阵列检测器、紫外检测器[13-16]。徐威等利用高效液相荧光检测方法检测动物性食品中土霉素和四环素残留。方法样品经含乙二胺四乙酸二钠的丁二酸钠缓冲液除蛋白后，由SPE-醋小柱提纯净化，ODS-醋柱分离，8%氧氯化锆溶液柱后衍生化，在激发波长406 nm和发射波长515 nm处检测土霉素和四环素与锆离子的螯合物含量，本方法稳定、快速、灵敏地检测到的结果为土霉素和四环素的回收率分别为89.59%和92.59%，最低检出浓度（信噪比5∶1）分别为3和5 μg·L-1，线性范围为10 μg·L-1～10 mg·L-1，相关系数分别为 0.999 和1.0000[13]。傅承光使用常规的反相色谱条件，结合柱后调节pH及胶束增敏，建立荧光检测方法，进一步提高了灵敏度。4种四环素类药物同时测定，检出限达到8.0～75.6 pg水平，适于测定样品中痕量四环素类药物[14]。张春艳等应用反相高效液相色谱-二极管检测器（DAD），测定了乳及奶粉中四环素的含量，四环素浓度在1～100 ng呈良好线性关系，r＞0.9996，平均加标回收率79.6%～102.0%，CVN2.28%～4.57%[15]。蔡颖等利用反相高效液相色谱-紫外检测测定了乳制品中土霉素、四环素和金霉素残留量，检测限分别为土霉素15.0 μg·kg-1，四环素20.0 μg·kg-1、金霉素18.0 μg·kg-1，回收率为86.0%～102.3%[16]。

5.3 高效液相结合化学发光法

化学发光分析法（HPLC-CL）具有灵敏度高、线性范围宽、仪器设备简单等优点，加上高效液相色谱具有高效分离的特性，使得HPLC-CL法成为一种有效的痕量及超痕量分析技术。张琰图等提出了一种高效液相色谱-化学发光法检测4种四环素类抗生素药物的新方法，同时分离检测4种抗生素的总时间为11 min[17]。此方法是基于四环素类抗生素药物中的四环素、土霉素、金霉素和多西环素能够强烈增敏通过恒电流电解方法在线电生BrO-和鲁米诺之间产生的化学发光，4种抗生素的检出限为0.002～0.008 μg·mL-1。

5.4 高效液相-质谱联用法

色谱的优势在于分离，为混合物的分离提供了最有效的选择，但其难以得到物质的结构信息，主要依靠与标准物对比来判断未知物。质谱能够提供物质的结构信息，用样量也非常少，但其分析的样品需要进行纯化，具有一定的纯度之后才可直接进行分析。高效液相-质谱联用法（LC-MS-MS）已经广泛应用在猪肉、牛奶等的检测[18-21]。

5.5 高效液相色谱-电喷雾离子阱质谱联用法

杨红梅等利用高效液相色谱-电喷雾离子阱质谱联用测定乳制品中6种四环素类抗生素的残留，采用多反应监测正离子模式，可1次对6种四环素类抗生素进行定性和定量分析，该方法的检出限0.5～4.0 μg·L-1，测定低限牛奶为0.6～4.5 μg·L-1，乳粉为6.0～45.0 μg·kg-1，线性范围4.0～100.0 μg·L-1，加标回收率56.1%～104.9%，相对标准偏差为2.5%～15.0%，该法具有样品预处理简单、灵敏度高、分析时间短等优点[21]。康莉等用高效液相色谱-电喷雾离子源串联质谱法同时检测了猪肝样品中四环素类及克伦特罗药物的最低检出限为0.02～0.56 μg·kg-1，样品平均加标回收率为84.4%～101.7%[22]。孙雷等用高效液相色谱-电喷雾离子源串联质谱方法检测了猪肉组织中四环素类药物的残留，四环素、土霉素和金霉素在10～400 ng·mL-1浓度范围内呈现良好线性，相关指数r＞0.999，方法检测限为5 ng·g-1，定量限为10，50、100和200 ng·g-13个添加浓度的平均回收率为72.3%～94.6%，批内批间RSD均＜20%[23]。

5.6 高效液相色谱-串联四极杆质谱联用法

闫龙宝等采用高效液相色谱-串联四极杆质谱联用法测定了婴幼儿配方奶粉中5种四环素类抗生素残留量，采用电喷雾正离子MRM模式检测，该方法的检出限为0.5～1.0 ng·mL-1，方法定量下限为5.0 ～10 μg·kg-1，线性范围0.5～20.0 ng·mL-1，加标回收率84.2%～92.5%，相对标准偏差为2.20%～4.07%[24]。李月欢等采用超高效液相色谱-电喷雾串联四极杆质谱仪快速测定畜、禽肉样品中土霉素、四环素、金霉素的最低检出限（LOD）分别为0.1、0.1、0.5 μg·kg-1，在5.0～80.0 ng·mL-1的线性范围内，相关系数r＞0.99，回收率在82.6%～111%，而且电喷雾串联四极杆质谱的MRM扫描方式抗干扰强，使方法的灵敏度更高，选择性更好，超高效液相色谱-电喷雾串联四极杆质谱法适于畜、禽类食品中痕量土霉素、四环素、金霉素的痕量分析[25]。

6 高效毛细管电泳法

高效毛细管电泳法原理是在毛细管柱中充入缓冲溶液，插入处于同一水平的两个缓冲液槽中，样品从毛细管的一端（称进样端）导入，当毛细管的两端加上一定的电压时，带电溶质便朝与其电荷极性相反的电极方向移动。由于组分间的浓度不同，迁移速度不同，所以经过一定时间后，各组分别将按其速度或浓度大小排序，依次到达检测器而被检出，得到按时间分布的电流谱图。此法具有操作简单、色谱柱不受样品污染、分析速度快、分离效率高、样品用量少、运行成本低等优点[26]。固相萃取-高效毛细管电泳技术可以检测牛奶中四环素类抗生素，梁佳等采用固相萃取-高效毛细管电泳法（SPE-HPCE）同时检测了牛奶中四环素、氯霉素、土霉素和金霉素的含量，在15 min内完全分离4种抗生素，检测限（μg·mL-1）分别为0.5、1.5、1.0、0.5，该方法简单、可靠，灵敏度高[26]。Israel用建立在二氧化硅吸附剂的基础上的磁固相萃取-毛细管电泳技术检测牛奶中的四环素类抗生素[27]。邢晓平运用高效毛细管电泳-电化学检测法（HPCE-ED）对鸡蛋中残留的四环素、土霉素进行了快速测定分析[28]。韦寿莲等首次采用柱端射壁电导检测方法，结合滤波技术以pH 4.0 Tris2Cit为分离介质，用毛细管电泳-电导检测对土霉素、金霉素、强力霉素和四环素进行了分离[29]。还有胶束电动毛细管色谱技术分离4种四环素类抗生素[30]。

7 免疫分析法

免疫分析法的基本原理是以抗原或半抗原和抗体特异性结合为抗原-抗体复合物的免疫反应为基础的生化测试技术。免疫分析法主要有放射免疫分析（RIA）、酶免疫分析（EIA）、荧光免疫分析（FIA）和酶联免疫吸附法（ELISA）。免疫分析技术具有操作简单快捷、速度快、灵敏度高、分析成本低等优点。此法在蜂蜜中已有应用[31]。

7.1 放射免疫分析法

陆勤等用放射免疫方法检测了牛奶中四环素类抗生素的残留，该法检测牛奶中四环素、土霉素、金霉素3种四环素类药物的最低浓度可分别达到30、100、50 μg·L-1，RSD＜3.9%（n=6）[32]。

7.2 酶联免疫吸附法

酶联免疫吸附试验主要是将抗原（或抗体）吸附于固相载体，在载体上进行免疫酶染色，最后底物显色用肉眼或分光光度计判定结果的一种检测方法。ELISA检测技术因其灵敏度高，特异性强，检测范围在ng～pg水平，属于超微量分析技术[33]。其干扰小，抗原抗体的免疫反应特异性强，结构类似物、有色物质、荧光物质对检测的干扰很小；操作简便快捷，由于特异性强，简化了样品的预处理和提取纯化过程，可同时检测数十甚至上百个样品；安全性高，污染少，因为灵敏度高，标准品的浓度可以很低，有机溶剂用量较少，减少对检测人员和环境的潜在危害。但ELISA也存在一些缺陷，如对试剂的选择性很高，不能同时分析多种成分；对结构类似的化合物有一定程度的交叉反应；分析分子量很小的化合物或很不稳定的化合物有一定的困难。随着基础研究的进展、ELISA技术的不断改进以及用于畜产品药物残留量分析ELI⁃SA试剂盒的大量生产，ELISA方法的优势将更加突出，更加符合畜产品分析的准确、快速、简便、易操作的要求。国占宝基于定量检测动物源性食品中四环素类抗生素的残留量，开发研制四环素类抗生素竞争酶联免疫（ELISA）检测试剂盒线性检测范围为0.05～4.05 ng·mL-1，灵敏度为0.05 ng·mL-1[34]。

8 胶体金免疫层析法

胶体金免疫层析检测方法是基于胶体金免疫技术，试剂条胶体金结合垫上包被微生物受体抗体胶体金复合物，检测线T分别包被青霉素G抗原和金霉素抗原，控制线C包被微生物受体二抗。当样品中含有β-内酰胺类和四环素类药物时，会与检测线包被抗原竞争结合金标复合物，金标复合物与检测线包被抗原结合形成红色线，未与检测线包被抗原结合的金标复合物移动到控制线与第二抗体结合形成红色线。检测线显色的强度与样品所含药物浓度成反比，检测线浅于控制线为阳性，检测线深于或等于控制线为阴性，控制线不全或没有颜色为无效检测。胶体金免疫层析法的显著优点是操作简便快速、灵敏度高、特异性强、可以目测结果。最快可在10 min内就完成一批8份样品的检测，大幅提升了检测速度，并且无需昂贵的仪器，有助于现场检测和大批量样品的初筛[35]。该方法在水产品中四环素检测已有应用。付云洁采用试纸条法检测金霉素检测限为0.7 μg·mL-1，在四环素质量浓度＞1.0 μg·mL-1时，与金霉素存在交叉反应性，其结果与高效液相色谱法测定的结果一致，本方法检测时间仅需5 min，适用于食品中金霉素残留的快速检测[36]。

9 生物芯片技术

生物芯片技术是一种以膜、玻璃、硅等固相介质为载体，能快速并行处理多个生物样品，并对其所包含的各种生物信息进行解析的微型器件，具有快速、高效、并行处理及分析自动化能力，其最大的优点在于高通量、并行化、微型化。在生物芯片上，单位面积内可以高密度地排列大量的生物探针，已经实现产业化的生物芯片可排列5～10万个探针·cm2。借助生物芯片技术，一次试验就可同时检测多种疾病或分析多种生物样品。目前成为畜产品兽药残留检测的一个高效便捷的平台，具有极高的推广价值[37]。Adrian等也应用生物芯片技术对牛奶中的几种抗生素和四环素进行了检测[38]。

10 小结

目前高效液相色谱及其与其他检测方法联用，已经广泛于畜产品中四环素类抗生素的检测。但在我国关于毛细管电泳检测技术、胶体金免疫层析法和生物芯片技术在畜产品中抗生素的检测应用报道比较少，随着这些方法的不断完善，将会得到广泛应用。

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