高羊茅种子贮藏蛋白的初步分析

魏 明 何 勇 金 强 田志宏

（长江大学生命科学学院 湖北 荆州 434025）

高羊茅（Festuca arundinacea）又名苇状羊茅，苇状狐茅，是禾本科羊茅属（Fescue）多年生丛生草本植物，是冷地型禾本科草种中抗热抗干旱性最强的草种之一[1]。近几十年来，高羊茅越来越多的应用于草坪，新品种也逐年增加。如何快速准确地区分这些品种成为草坪工作者共同关注的问题。由于我国除少量的结缕草品种外，其余草种长期以来一直依赖于国外引种[2]，加之国内部分种子经营者片面追求经济效益而忽视质量，造成国内市场上高羊茅品种混杂、亲缘关系不清，给良种保护和新种开发带来了极大的不便。

在成熟谷类种子中，总蛋白约为种子干重的7%～16%，其中大部分为贮藏蛋白。通常根据蛋白质的溶解性，将种子贮藏蛋白质分为4类：水溶蛋白、盐溶蛋白、醇溶蛋白和碱（或酸）溶蛋白[3]。禾本科种子中的贮藏蛋白，呈现丰富的多样性，并且很少受植物生长环境、世代和收获年限的影响。贮藏蛋白是影响种子品质的因素之一，自Bushuk于1978年提出醇溶蛋白的酸性聚丙烯酰胺凝胶电泳（A-PAGE）方法以来[4]，种子贮藏蛋白便作为遗传标记已被广泛应用于禾谷类作物种、属间关系、种内遗传多样性分析、品种鉴定及植物繁育系统的鉴别[5-10]，但在草坪草的品种鉴定方面却鲜有报道。

为了满足我国草坪业的进一步发展需求，本文采用种子贮藏蛋白电泳技术，对市售高羊茅种子进行贮藏蛋白分析，以求从蛋白质水平上探讨高羊茅的遗传多样性，阐明其种子蛋白水平的遗传差异，为高羊茅品种间遗传差异及高羊茅种质资源的分类鉴定提供一定参考。

1 材料与方法

1.1 材料

选用近年来国内市场较为常见的18个高羊茅品种（表1）。

1.2 方法

1.2.1 样品制备

每个品种取完整籽粒200粒，去颖壳后经粉碎机粉碎，过80目筛，取样品0.08g装入1.5mL离心管中，加入样品提取剂1mL，震荡5min摇匀。在室温下放置（水溶蛋白室温浸提24h，醇溶蛋白室温浸提12h），再将离心管转移至沸水浴中煮沸10 min，最后在12000r/min的速度下离心10min，上清液即为种子贮藏蛋白质的提取液，取上清液4℃贮藏备用[11]。

表1 供试高羊茅品种表

1.2.2 电泳

参照农业行业标准《玉米种子纯度盐溶蛋白电泳鉴定方法》（NT/T499-2001）[12]中的乳酸－聚丙烯酰胺凝胶电泳方法，对其进行改进（表2），使用北京六一仪器厂制造的DYY-10三恒型电泳仪和DYY-Ⅲ28B型垂直双板夹芯式电泳槽，水溶蛋白用50%甘油做提取剂，醇溶蛋白用75%乙二醇做提取剂，不连续SDS-PAGE浓缩胶的浓度为5%，分离胶浓度为12%可以达到最佳的分离效果。浓缩胶、分离胶配方见表2。

表2 凝胶的配制

1.2.3 染色

胶板剥离后，加入至少5倍分离胶体积的固定液（80%甲醇，20%冰乙酸）固定1 h，溴酚蓝指示剂由蓝色变为黄色后，倒去固定液，蒸馏水冲洗数次，加入与固定液等体积染色液（0.125 g考马斯亮兰R-250溶于250 mL固定液）染色3 h以上或40℃染色40 min，倒去染色液，蒸馏水冲洗数次，洗净凝胶表面残留染色液[22-24]，（5%甲醇、7.5%冰乙酸）震荡脱色，每30 min更换一次脱色液，直至背景脱至无色，10%的醋酸溶液中保存或拍照保存。

1.2.4 贮藏蛋白电泳谱带统计及聚类分析

用0、1表示电泳谱带的有无，在相同迁移位置上有蛋白质谱带的记为1，无带记为0，建立资料数据库并使用软件NTSYSpc 2.1进行高羊茅品种聚类分析。

2 结果与分析

2.1 水溶蛋白谱带分析

18个品种的高羊茅种子水溶蛋白共表现出20条谱带（图1、图2），最多的表现出18条带，最少的表现出15条带，但各品种间的条带差异不大，特异性的条带不多（图2）。

图1 18个品种的高羊茅种子水溶蛋白电泳图谱

图2 18个品种的高羊茅种子水溶蛋白电泳图谱示意图

2.2 醇溶蛋白谱带分析

18个品种的高羊茅种子醇溶蛋白共表现出27条谱带（图3、图4），最多的表现出24条带，最少的表现出11条带。条带特异性比较明显（图4）。

图3 18个品种的高羊茅种子醇溶蛋白电泳图谱条带

图4 18个品种的高羊茅种子醇溶蛋白电泳图谱条带

2.3 贮藏蛋白谱带聚类分析

高羊茅贮藏蛋白中的盐溶蛋白和醇溶蛋白聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱，从不同角度反映了供试品种的蛋白质多态性，但进行综合比较发现用水溶蛋白做聚类分析效果不佳，不能完全区分品种，因此采用醇溶蛋白来做聚类分析。

表3 18个品种的高羊茅遗传相似性系数

按Nei氏 （1983）公式计算品系间的遗传相似性系数（GS）（表 3）。 GS＝2Nij/（Ni＋Nj），其中 Ni为材料 i中出现的条带数，Nj为材料j中出现的条带数，Nij为材料i和材料j共有的条带数。遗传差异即遗传距离GD=1-GS。遗传相似系数从 0.3333333到 0.9629630。

以各品种遗传相似系数为基础，利用软件NTSYSpc 2.1中的非加权组法（UPGMA）进行高羊茅品种聚类分析，从图5看来，以带型遗传相似性系数GS＝0.67为度，可将18个供试品种划分为2个类群：园里、RTF、凌志Ⅱ、千年盛世、雅典娜、踏火、红宝石、3A、贝壳、爱瑞3号和顶峰聚为一类（类Ⅰ）；时尚、翠碧A、法恩、锐步、火凤凰、猎狗5号和选手聚为另一类（类Ⅱ）。

图5 18个品种的高羊茅聚类分析树状图

3 讨论

分子生物学研究表明，品种之间的差异主要取决于遗传物质的差异，蛋白质是基因的产物，可作为品种鉴定的依据[13]。本实验利用SDS-PAGE对市售的18个品种的高羊茅种子贮藏蛋白进行分析，共得到水溶蛋白谱带20条、醇溶蛋白谱带27条，综合比较后发现各品种间的水溶蛋白谱带差异不大，特异性的条带不多，醇溶蛋白谱带特异性比较明显，遗传相似系数从0.3333333到0.9629630，可见在高羊茅品种间有一定数量的种子贮藏蛋白编码基因的等位变异，同时也表明通过种子贮藏蛋白电泳可对高羊茅的品种鉴定以及育种和种植提供一定的参考，但在育种工作中，尚需要结合不同品种的性状表现，对这些品种的聚类分析结果给以合理的理解，并将其应用在亲本选配中进行生态育种。由于并非所有的基因都编码或影响种子贮藏蛋白，所以有些重要性状的遗传尚需要结合同功酶或DNA谱带的分析。

在不连续电泳系统中，浓缩胶的存在可浓缩样品、提高电泳谱带的分辨率，但减少了分离胶的有效面积和样品的电泳距离，使电泳谱带不能很好地加以区分[8]，这种情况在本实验中也有发生，在进一步的实验中将根据实际情况做进一步改进，使之更加体现品种鉴定高效、快速的特点。

［1］孙吉雄.草坪学[M].北京：中国农业出版社，2003，3：89-90.

［2］高志民，王雁.草坪草引种栽培研究现状及存在的问题[J].中国草地，2000（3）：60－65.

［3］阮禹松，赵文明.种子盐溶球蛋白的结构特征[J].西北植物学报，2002，22（4）：999－1003.

［4］Bushuk W.Wheat cultivar identification by gliadin electrophoregrams[J].Can J Plant Sci， 1978，58：505－515.

［5］胡志昂，王洪新.蛋白质多样性和品种鉴定[J].植物学报，1991，33（7）：556-564.

［6］马瑞君，李常宝，刘艳玲，等.四种沙棘种子可溶性蛋白谱带分析研究[J].沙棘，1997，10（3）：3-9.

［7］黄秀丽，庄东红，胡忠，等.南瓜属4个栽培种种子蛋白质电泳分析[J].武汉植物学研究，2005，23（2）：183－187.

［8］孙雁，朱有勇，朱永平，等.蛋白质电泳在豌豆品种鉴定中的应用[J].种子，2004，23（2）：25，30.

［9］J.L.Karihaloo ， Manjeet Kaur and Sonika Singh.Seed protein diversity in Solanum melongena L.and its wild and weedy relatives[J].Genetic Resources and Crop Evolution，2002，49：533-537.

［11］马国芳，李钧敏，边才苗.白菜种子贮藏蛋白的聚丙烯酰胺凝胶电泳分析[J].中国蔬菜，2004（3）：33，34.

［12］NT/T499-2001米种子纯度盐溶蛋白电泳鉴定方法[S].

［13］颜启传，邓光联，支巨振.农作物品种电泳鉴定手册[M].上海：上海科学技术出版社，1998.