野菊花栓微生物限度检查法验证

周焕净

广西古方药业有限责任公司，广西 南宁 530221

1 野菊花栓微生物限度检查法标准

1.1 野菊花栓微生物限度检查法标准起草说明

野菊花栓具有抗菌消炎的功效，适用于前列腺炎及慢性盆腔炎等疾病的治疗。主要成分为野菊花，辅料为聚乙二醇。根据其用药途径和处方，应进行细菌数、霉菌和酵母菌数的测定、和大肠埃希菌的检查。

经实验研究，最终确定采用常规法进行细菌数、霉菌和酵母菌数的测定检查。经对所确定的方法进行验证，符合2010年版《中国药典》一部附录XIIIC微生物限度检查法的有关规定，方法可行。

1.2 野菊花栓微生物限度检查法标准正文

微生物限度 照微生物限度检查法(《中国药典》2010年版一部附录XIIIC)。

取样品10g，加含适量聚山梨酯80的PH7.0无菌氯化钠—蛋白胨缓冲液稀释至100ml，制备成溶解均匀的1:10的供试液。

细菌数 取本品1:10的供试液1ml注皿，平行制备2个平皿，置30～35℃，培养72小时，计数。

霉菌和酵母菌数 取1:10的供试液1ml注皿，平行制备2个平皿，置23～28℃，培养120小时，计数。

细菌数每1g不得过100个，霉菌和酵母菌数每1g不得过10个。

2 野菊花栓微生物限度检查法验证的实验研究

按《中国药典》2010年版一部附录XIIIC微生物限度检查法规定进行方法验证。

2.1 实验仪器、试药

2.1.1 样品 野菊花栓，批号:100601、100602、100603。

2.1.2 培养基及稀释剂

营养琼脂培养基，玫瑰红钠琼脂培养基，营养肉汤培养基，胆盐乳糖培养基 (BL)，改良马丁培养基，改良马丁琼脂培养基，pH7.0无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液，0.9%无菌氯化钠溶液、甘露醇氯化钠琼脂培养基、溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基、曙红亚甲蓝琼脂。

2.1.3 仪器

天平，培养箱，冰箱，高压灭菌锅等。

2.2 细菌、霉菌及酵母菌试验方法的建立及验证

2.2.1 菌液制备

取经30～35℃培养18～24小时的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌的肉汤培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制备成每1ml含菌落数为50～100cfu/ml的菌悬液，备用;取经23～28℃培养24～48小时的白色念珠菌液体培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制备成每1ml含菌落数为50～100cfu/ml的菌悬液，备用;取经25℃培养的1周的黑曲霉斜面培养物，加5ml含0.05%聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱，吸取菌液用含0.05%聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液制备成每1ml含菌落数为50～100cfu/ml的菌悬液，备用。

2.2.2 供试液制备

取样品10g，加含适量聚山梨酯80的PH7.0无菌氯化钠—蛋白胨缓冲液稀释至100ml，制备成溶解均匀的1:10的供试液。

2.2.3 常规法 取1:10的供试液1 ml和50～100cfu菌液，分别注入平皿中，立即倾注15～20 ml琼脂培养基，待凝固后，置规定温度，细菌培养72小时，霉菌和酵母菌培养120小时，计数，测定回收率。

2.2.4 结果，回收率均超过70%，表明野菊花栓无抑菌作用，采用常规法进行细菌数、霉菌和酵母菌数的计数可行。用pH7.0无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液作为稀释剂对照组回收率均超过70%，表明稀释剂无抑菌作用。

2.2.5 细菌、霉菌及酵母菌计数方法验证

取3个批号野菊花栓样品，按常规法进行加菌回收率试验，结果见表1。

表1 三批野菊花栓回收率试验结果

三个批号样品的回收率试验结果表明，野菊花栓采用常规法进行细菌、霉菌和酵母菌微生物限度检验，五种规定试验菌的回收率均超过70%;符合《中国药典》2010年版一部的规定，方法可行。

确定野菊花栓细菌、霉菌和酵母菌计数方法为常规法。

3 野菊花栓微生物限度检查方法

根据上述试验研究结果，拟建立野菊花栓微生物限度检查方法如下:

微生物限度 照微生物限度检查法(《中国药典》2010年版一部附录XIIIC)。

取样品10g，加含适量聚山梨酯80的PH7.0无菌氯化钠—蛋白胨缓冲液稀释至100ml，制备成溶解均匀的1:10的供试液。

细菌数 取本品1:10的供试液1ml注皿，平行制备2个平皿，置30～35℃，培养72小时，计数。

霉菌和酵母菌数 取1:10的供试液1ml注皿，平行制备2个平皿，置23～28℃，培养72小时，计数。细菌数每1g不得过1000个，霉菌和酵母菌数每1g不得过100个，金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌每1g不得检出。

4 三批野菊花栓的微生物限度检查

表2 三批野菊花栓微生物限度检查结果

按上述所建立的野菊花栓微生物限度检查法，对三批样品进行检验，结果见表2。

三个批号样品的微生物限度检查结果表明，野菊花栓采用常规法进行细菌、霉菌和酵母菌微生物限度检验，符合《中国药典》2010年版一部的规定，方法可行。

确定野菊花栓细菌、霉菌和酵母菌计数方法为常规法。

［1］中国药典［S］.2010:79.

［2］药品微生物检验手册［M］.科学出版社，2001:40.

［3］现代医药工业微生物实验室质量管理与验证技术［M］.中国协和医科大学出版社，2004:3.