亚低温预处理大鼠脊髓内手术模型的建立

程 光 杨杉杉

(河北联合大学临床医学院中心实验室 河北 唐山 063000;①唐山市眼科医院)

临床上，因脊髓内肿瘤、动静脉畸形、空洞等必须施行手术的病例比较多见，但髓内手术的锐性切开与牵拉本身也是一种损伤，常常会因此而导致严重不良后果，有的甚至因继发截瘫而遗恨终身。如何预防或减少这种医源性脊髓损伤一直是神经外科工作者追求的目标。有许多文献表明[1～3]，低温，尤其是局部亚低温的治疗具有肯定的脊髓神经保护作用。根据这一原理，设想如果在切开脊髓前局部用低温技术将脊髓进行亚低温预处理，是否也可以减轻髓内手术时因切开、牵拉、暴露等操作导致的脊髓副损伤，发挥其保护作用?为了探讨亚低温预处理对减轻脊髓内手术医源性损伤的可行性与实用性，首先建立既符合临床特征，又具有可操作性、可复制性的动物模型是先决条件。本实验则是为深入探讨亚低温预处理对脊髓内手术保护方法及其机制而进行的大鼠模型建立方法的研究。

1 材料与方法

1.1 动物与分组 雄性SD大鼠108只(北京维通利华公司，合格证书:0097414)，体质量(300±10)g，10周龄，适应性饲养1W，自然光照，自由饮食，实验前12小时禁食，不禁水。将108只大鼠随机分为3组:常温下脊髓切开组(n=36)，亚低温预处理脊髓切开组(n=36)，对照组(n=36)－硬脊膜外低温盐水灌注后不施行脊髓切开术。每组分 4h、8h、1d、3d、7d、14d 6个不同时间窗取材，进行HE染色观察病理变化。后者按照低温预处理方法及温度检测进行。

1.2 大鼠脊髓内手术模型的复制 10% 的水合氯醛(0.3mL/100g)腹腔注射麻醉后，俯卧固定，剪去背部被毛。无菌条件下背正中切口，显露T11～13棘旁椎板，切除椎板显露脊髓硬膜并切开。在手术显微镜下沿背正中沟切开脊髓长1cm，深1.5mm，放入1mm×2mm恒力撑开片，持续时间为1h后取出撑开片，关闭切口。术后肌注青霉素3d，10万U/d，室温保持在20～25℃，特殊护理饲养。

1.3 低温预处理方法及温度监测 ①用缝线向上悬挂切口周边皮肤，使之形成一小蓄水池。于硬脊膜外，采用4℃低温生理盐水通过输液管从一端灌注，流量50ml/min，同时用吸引器在另一端向外引流。灌注时间为1h。②电子体温计置于椎旁肌下，测温度降至(33±1)℃。

1.4 标本的采集及石蜡切片的制备 按照设计的时间窗宰杀大鼠，剖开胸腔显露心脏，经主动脉穿刺快速注入生理盐水150～200mL，经剪开右心耳放血，待流出血液变清亮后，快速注入4%多聚甲醛PBS固定液200mL，再以200mL相同固定液维持滴注1h后取材。以损伤部为中心取脊髓1cm，浸泡于同样的固定液中，后固定过夜。然后常规脱水，固定、石蜡包埋，作冠状面连续切片，切片厚度为5μm，HE染色，进行病理组织学观察。

1.5 统计学处理 实验中所得数据应用SPSS 11.5软件分析，两组间比较采用独立样本t检验。P＜0.05为具有显著性差异。

2 结果

2.1 低温灌注前后直肠和脊髓温度监测结果 硬脊膜外低温灌注1h后棘旁肌内温度明显低于灌注前，直肠温度也较灌注前有轻度下降，二者均同步下降5℃左右，见表1。

表1 亚低温灌注前后直肠温度与椎旁温度比较(℃，)

表1 亚低温灌注前后直肠温度与椎旁温度比较(℃，)

注:与低温灌注后比较，△ P ＜0.01，*P ＜0.05

项目 例数 直肠温度 椎旁温度低温灌注前 36 35.2±0.2△ 33.4±0.4*36 33.0 ±1.7 30.6 ±1.5低温灌注后

2.2 病理组织学变化 对照组神经细胞外形清晰，极性存在，核圆，核仁清楚，细胞核轮廓清晰光滑，轴丘清楚，组织无明显水肿、出血和炎性细胞浸润等表现。常温组光镜下可见4h脊髓后索、部分灰质及侧索出血，白质水肿，神经纤维紊乱，前后角的部分神经元肿胀，极性消失。8h肿胀的神经元增多，白质肿胀加重，神经纤维的髓鞘板层分离且散乱。灰质中出血灶可融合成片，神经元可呈淡染、尼氏体消失、少数细胞崩解。神经轴索肿胀，髓鞘进一步分离散乱，有的破裂。1d白质也呈片状出血，在灰质出血区可见灰质破碎及坏死，有的形成小囊腔。神经元明显减少，见图1。部分白质开始破碎，神经轴索浊肿，髓鞘破碎，

见图2。3d脊髓液化及坏死面增大，白质的近灰质部分神经轴索浊肿、破碎、髓鞘破碎，而周边部分则变化较轻。7d脊髓中央部大部分坏死，残存周边部分白质，其神经轴索浊肿、退变、髓鞘碎裂。伤后14d，坏死区域有空洞形成，并可见大量胶质细胞增生侵入，周边部分白质保存，部分轴索浊肿退变，崩解，出现微囊。低温预处理组相应的组织病理学损害出现的时间与常温组基本相同，但病变的范围较小，损害的程度也较轻，见图3、4。

图4 常温组24h灰质

图5 常温组24h白质

图6 低温组24h灰质

图7 低温组组24h白质

3 讨论

在生命科学领域中，实验研究是学科发展的基础，尤其是动物实验，是生命科学实验研究中的重要组成部分。为了保证动物实验更科学、准确和重复性好，本实验研究的动物模型是按特定需要设计、用大鼠模拟人体的一种模型，其复制符合最优化的原则。

3.1 脊髓内手术锐性切开+牵拉损伤动物模型的建立 目前SCI模型繁多，在 SCI模型中 Allen[4]的 WD 法经 Freeman Wright[5]、Ford[6]等改良，至今已成为比较成熟、完善、研究中最为广泛的SCI模型。但是，模拟脊髓内手术所致的锐性切开+牵拉性损伤的动物模型还未见有报道。本实验大鼠模型设计理论基础为:①选择T11～13段进行操作，首先是因为该处是脊柱的最高点，手术操作方便，且能避开骶髓排便中枢便于术后管理;其次脊髓损伤节段越高，损伤后动物的死亡率亦越高，故选择该三节段死亡率低。②T11～13段脊髓直径只有3.1～3.5mm，制作模拟术中牵开器较为困难，选择切开脊髓后放入厚度为0.8mm撑开片的方法可起到形同向两侧牵开脊髓组织的同样作用，且对于两侧脊髓组织牵拉的力量恒定均等，故使用撑开片代替牵开器。③T11～13脊髓的长度分别为 4.5、4.3、4.0mm，宽度分别为3.1、3.3、3.5mm[7]。故将撑开片制作成长 6mm、宽 0.8mm、高1.5mm的塑料板，通过脊髓后正中切开长1cm、深1.5mm切口而放入。由此本模型既可模拟临床髓内手术切开+牵拉性损伤的致伤条件和受伤机制，又可保证部位固定、牵开力的恒定，具有高度的可复制性。

3.2 脊髓亚低温的实施 脊髓的低温实施有多种方法，大体可分为两类:①系统低温，即让包括脊髓在内的整个机体的温度降低，以达到治疗目的，有冰浴降温、药物降温、血液降温、传导降温、空气对流降温等方法。医用自动降温毯是一种较好的系统降温工具，可控性好且具有降温、复温双重功能，临床上得到了较广泛的应用。②局部低温，是用多种方法使脊髓等某一个或几个器官温度降低，而机体温度保持不变或变化不明显的治疗方法。其应用方法包括如局部低温液体灌注、热能交换器等。但之所以得出亚低温治疗SCI截然相反的结论，很可能是由于实验设计中的一些不同处理方法造成的。包括:①实验动物品种的差异;②麻醉药品及麻醉方法的不同;③脊髓损伤的方式不同;④其他药物的选择;⑤硬脊膜是否开放;⑥低温技术的掌握及运用存在差别;⑦低温监测的方法不同等。

本实验所采用脊髓内切开+牵拉型SCI模型的主要病理改变系由于髓内压迫缺血所致，术后随时间变化可发现常温组大鼠脊髓会发生诸如出血、变性、坏死、液化以及胶质瘢痕形成等病理形态学变化，高倍镜下可见到细胞坏死、崩解、脊髓大面积空泡样变等。在脊髓未切开前，施行硬脊膜外4℃生理盐水缓慢灌注1h进行预处理是安全而可行的，既不会对正常的脊髓组织形态造成损害，还可能具有预防或减轻髓内手术后继发性损伤的作用。

总之，本大鼠模型具有经济性、适用性、易行性、重复性、可靠性、稳定性、可控性等特点，符合脊髓内手术的临床特征。可以作为深入研究亚低温预处理对髓内手术继发性损伤的保护作用及其机理的动物模型。

[1]Albin MS，White RJ，Locke GE.Treatment of spinal cord trauma by selective hypothermia perfusion[J].Surg Forum，1965，16:423

[2]程爱国，冦用礼，张宝兴，等.低温药物灌注综合手术方法治疗急性脊髓损伤6例报告[J].临床医学杂志，1986，2(2):73

[3]杨迎暴，朴英杰.脊髓损伤模型的建立及其评价标准[J].中华创伤杂志，2002，18:187

[4]Allen AR.Surgery of experimental lesions of spinal cord equivalent to crush injury of fracture dislocation[J].Preliminary Report，JAMA，1911，57:878

[5]Freeman LW，Wright GW.Experimental observations of concussion and contusion of spinal cord[J].Ann Surg，1953，137:433

[6]Ford RW.A reproducible spinal cord injury model in the cat[J].J Neurosury，1983，59:268

[7]杨安峰，王 平.大鼠的解剖和组织[M].北京:科学出版社，1985.159