β防御素-2和白细胞介素-1β在寻常型银屑病患者皮损中表达的研究

张平平 甄 莉

山西医科大学第一医院皮肤科，山西 太原 030001

银屑病是一种常见并易复发的慢性炎症性皮肤病。近年来，对银屑病发病机制的研究日益深入，多数学者认为，银屑病与免疫功能紊乱有关[1]。目前认为，T细胞介导的免疫紊乱是银屑病发生发展的基础。由于免疫调节主要是通过细胞因子之间的相互作用来实现的，因而，细胞因子在银屑病发病中的作用愈来愈受到人们的重视。白细胞介素-1β（IL-1β）是重要的细胞因子之一，在银屑病皮损中由活化的T淋巴细胞释放。杨琴等[2]用IL-1β干预HaCat细胞后发现，人防御素-2 mRNA的表达增加，且银屑病患者β防御素-2（HBD-2）表达增强。有研究显示，防御素有抗菌的作用，但当防御素大量表达时与IL-1β共同作用可使溃疡性结肠炎患者的炎症加剧。本研究采用实时荧光定量RT-PCR技术在转录水平检测银屑病皮损中HBD-2、IL-1β mRNA表达情况，以观察两者是否共同参与了银屑病的发病过程。现将实验具体情况报道如下：

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2009年5月～2010年5月于我院皮肤科门诊就诊及住院的银屑病患者45例，均具有典型皮损并经病理确诊。排除标准：不伴有合并系统性疾病者，入组时至少1周未外用糖皮质激素，取材前3个月内未系统使用过免疫抑制剂、糖皮质激素、免疫增强剂者。采用银屑病皮损面积及严重度指数（PASI）进行评分，45例患者 PASI评分为 6.9～55.2分，其中，将 0～24分作为轻度组 （25例），25～48分作为中度组（12例），49～72分作为重度组（8例）。45例患者中，男 25例，女20例；年龄18～65岁，平均31.8岁。选择15例皮肤组织正常患者作为正常对照组，均为于我本院进行整形外科手术的非银屑病患者，其中，男9例，女6例；年龄16～56岁，平均34.5岁。

1.2 仪器及试剂

荧光定量PCR仪（西安天隆科技有限公司）、TL988型实时荧光定量PCR仪 （西安天隆科技有限公司）、Y200C型电泳仪 （北京君意东方电泳设备有限公司）、JY-SCZ型电泳槽（北京君意东方电泳设备有限公司）、离心机（湘仪离心机仪器有限公司）。RT-PCR逆转录试剂盒和TransZol试剂分别由宝生物工程有限公司和北京全式金生物技术有限公司提供。

1.3 实验方法

1.3.1 取材及标本处理 皮损区取材：银屑病皮损区切取典型皮损。非皮损区取材：银屑病皮损周围约1 cm处外观正常皮肤切取标本，均于-70℃冰箱内保存。

1.3.2 提取RNA 严格按照TransZol溶液试剂盒说明书进行操作提取RNA，每管样品取5 μL置1%的琼脂糖凝胶上进行电泳，电泳完毕后用溴化乙锭染色20 min，置紫外灯下观察。紫外分光光度计测吸光度值及计算样品浓度，并保存样品于-70℃备用。

1.3.3 逆转录合成 cDNA 反应体系 10 μL：5×PrimeScriptR

Buffer 2 μL，PrimeScriptR RT Enzyme Mix I 0.5 μL，Oligo dT Primer0.5 μL，Random 6mers0.5 μL，Total RNA 2 μL[0.5 μg/μ]，RNase Free dH2O 4.5 μL。 反应条件： 37℃ 15 min，85℃ 5 s。

1.3.4 RT-PCR扩增 取25 μL cDNA进行RT-PCR反应。预变 性 ：95℃ 30 s，1 个 循 环 ；PCR 反 应 ：95℃ 5 s，60℃ 30 s，72℃ 60 s，40个循环；72℃延伸 7 min，然后 4℃ 5 min保存。引物序列：Human-actin上游引物5'AGAGCTACGAGCTGCCTGAC 3'， 下游引物 5'AGCACTGTGTTGGCGTACAG 3'，产物长度为184 bp。HBD-2上游引物 5'ATTCCTGATGCCTCTTCC 3'，下游引物 5'GTGCCAATTTGTTTATACCTTC 3'，产物长度为 117 bp；IL-1β上游引物 5'GGGCCTCAAGGAAAAGAATC3'，下游引物 5'TTCTGCTTGAGAGGTGCTGA3'，产物长度为205 bp。反应结束后，得出Ct值，将原始Ct值进行2-△Ct转换，从而达到线性关系。相对定量的方法即比较Ct值法（2-△△Ct法）。

1.4 统计学方法

采用SPSS 17.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（）表示，多组比较采用秩和检验，以P＜0.05为差异有统计学意义；组间两两比较采用Bonferroni法，皮损、非皮损和正常对照组两两比较校正检验水准α'=0.017，P＜0.017为差异有统计学意义；皮损轻、中、重组和正常组两两比较校正检验水准α'=0.0083，P＜0.0083为差异有统计学意义。指标间相关性分析采用Pearson或Spearman相关分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HBD-2、IL-1β mRNA在寻常型银屑病患者皮损区、非皮损区和正常皮肤表皮中的表达情况

HBD-2、IL-1β mRNA在银屑病皮损组的表达高于正常对照组和银屑病非皮损组，且二者在银屑病非皮损组的表达高于正常对照组，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。见表1。

2.2 HBD-2、IL-1β mRNA在不同等级银屑病皮损组中的表达情况

HBD-2、IL-1β mRNA在轻、中、重度皮损中的表达逐渐升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表1 HBD-2、IL-1β mRNA在正常皮肤、银屑病患者非皮损区及皮损区的表达情况（）

表1 HBD-2、IL-1β mRNA在正常皮肤、银屑病患者非皮损区及皮损区的表达情况（）

注：与正常对照组比较，★P＜0.017；与银屑病非皮损组比较，※P＜0.017

组别 例数 HBD-2 mRNA IL-1β mRNA银屑病皮损组银屑病非皮损组正常对照组4545150.74±0.13※★0.32±0.04★0.11±0.010.64±0.15※★0.46±0.13★0.20±0.03

表2 HBD-2、IL-1β mRNA在不同等级银屑病皮损中的表达情况（）

表2 HBD-2、IL-1β mRNA在不同等级银屑病皮损中的表达情况（）

注：与正常对照组比较，※P＜0.0083

组别 例数 HBD-2 mRNA IL-1β mRNA轻度组中度组重度组正常对照组25128150.64±0.07※0.80±0.06※0.94±0.05※0.11±0.010.56±0.10※0.67±0.10※0.87±0.12※0.20±0.03

2.3 银屑病皮损区HBD-2、IL-1β mRNA的表达与PASI评分的相关性

HBD-2、IL-1β mRNA的表达与PASI评分呈正相关关系（P ＜ 0.05，r=0.887、0.771）。

2.4 HBD-2、IL-1β mRNA在银屑病皮损区表达的相关性

在银屑病皮损区HBD-2 mRNA与IL-1β mRNA表达呈正相关关系（P ＜ 0.05，r=0.691）

3 讨论

银屑病是一种免疫异常性慢性炎症增生性皮肤病。人们最初认为，银屑病原发于人角质形成细胞素紊乱。后来随着研究的深入，银屑病发病机制中目前较为公认的是T细胞介导的免疫机制[3]。IL-1β是重要的细胞因子之一，在银屑病皮损中由活化的T淋巴细胞释放。在银屑病等病理情况下，IL-1β和成熟IL-1β蛋白表达均有增加[4]。刘玮等[5]培养条件下IL-lβ诱导正常人皮肤表达银屑病的免疫病理表型，提示IL-1β参与了银屑病的皮损形成。本研究结果显示，IL-1β在银屑病皮损区表达显著加强，并与PASI评分呈现正相关，再次证实了IL-1β与银屑病皮损的形成有密切关系。

β防御素（HBD）家族是重要的天然免疫效应分子，其中包括 HBD-1、HBD-2、HBD-3、HBD-4 等[6]。1997 年 Harder等[7]从银屑病患者病损上皮分离纯化出HBD-2，此后，在包皮、肺、气管、口腔黏膜、皮肤的上皮组织中均发现其表达。除正常组织外，HBD-2主要在感染刺激后的皮肤和黏膜组织中表达[8]，提示HBD-2在宿主抵御微生物感染方面发挥重要作用。既往研究表明，HBD-2为可诱导性防御素，其表达可被许多物质上调，如 IL-1β、TNF-α、细菌、真菌、脂多糖等[9-10]。Bajaj-Elliott等[11]研究发现，细胞毒性幽门螺杆菌和IL-1β显著上调胃上皮细胞系AGS和MNK7细胞表达HBD-2。杨琴等[2]用IL-1β干预HaCat细胞后，发现人-防御素2 mRNA的表达增加。常玉英等[12]研究表明，阻断HBD-2后，下调Caco2细胞株对TNF-α和IL-1β mRNA水平的表达，且两者具有时效关系，提示HBD-2可能促进TNF-α和IL-1β的分泌。本研究发现，银屑病时HBD-2与IL-1β均表达增加且随皮损加重而表达增高，并与PASI评分呈现正相关关系，提示IL-1β与HBD-2之间可能存在互相作用而使皮损加重，可能共同参与了银屑病的发病过程，然而具体信号转导通路是如何存在，值得进一步深入研究。

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[2]杨琴，甄莉.白细胞介素-1β对Hacat细胞诱导产生β防御素-2表达的研究[J].中国药物与临床，2008，8（2）：126-127.

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[5]刘玮，赵庆利.白介素-1β诱导正常人皮肤表达银屑病免疫病理表型[J].中华皮肤科杂志，1999，32（2）：106-108.

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[11]Bajaj-Elliott M，Fedeli P，Smith GV，et al.Modulation of host antimicrobial peptide （beta-defensins1and 2）expression during gastritis[J].Gut，2002，51（3）：356-361.

[12]常玉英.防御素在炎症性肠病发病机制中的作用及其分子机制研究[D].成都：四川大学，2006.