siRNA的定量方法及其在药代动力学检测中的应用

侯召丽，王艳玲，王雅鹃，高玉青，戴伟业，李春雷

(石药集团中奇制药技术(石家庄)有限公司，河北 石家庄 050051)

1 RNA干扰(RNA interference，RNAi)与小干扰 RNA(Small interfering RNA，siRNA)

RNAi是指由双链RNA启动的序列特异的转录后基因沉默现象，广泛存在于真菌、植物和动物中。RNAi最主要的功能特色在于它可以下调或关闭特定基因的表达，进而调控细胞的各项高级生命活动，这不仅提升了人们对RNA分子的认识，更为各种传染性疾病的防治和肿瘤等医学顽症的根治开辟了一条新的途径［1］。目前，RNAi技术已应用于病毒性疾病研究、恶性肿瘤的治疗、新药的研究和开发等领域。

siRNA是一种小双链RNA分子，能够与核酸内切酶、核酸外切酶、解旋酶等构成RNA诱导的沉默复合体(RNA-induced silencing complex，RISC)，引发 RNAi机制，干扰特异基因的表达，从而使与之互补的目标mRNA沉默。siRNA具有特异性和高效性的特点，能够通过这种机制沉默某些可引发疾病的基因，现已成为许多疾病的潜在的治疗药物。

2 siRNA的药代动力学特性

核酸类药物与传统的药物相比，最显著的一个特性是易受到体内核酸酶的作用而迅速降解。据报道［2］，siRNA极不稳定，在血浆中由于核酸酶的存在，siRNA的半衰期不足15 min;另外，由于siRNA大小只有20～25个碱基，使用传统的PCR方法引物很难结合上去不利于测定;siRNA在体内的残留量少，浓度低，检测困难，这些都为siRNA药物的药代动力学研究带来困难。而对药物的药代动力学、疾病对其药代动力学过程的影响规律、合并用药对其药代动力学过程的影响规律等方面的研究，能够为药物的临床评价、临床应用方法、临床个体化给药方案的制定提供理论依据，对提高治愈率、缩短治疗时间、减少或消除毒副作用等发挥着积极的作用。

因此，设计合适的实验方案、建立准确可信的药代动力学研究方法对siRNA药物的开发和临床应用至关重要。

3 siRNA的定量方法

3.1 PCR定量法

实时荧光定量 PCR(Real-time Quantitative PCR，qRTPCR)通过荧光染料或荧光标记的特异性探针，对PCR产物进行标记跟踪，可以在反应进行过程中进行累积扩增产物的分析和检测，它的主要优点是可以准确地确定初始模板拷贝数、宽的动态范围及高的灵敏度。目前已有许多基于SYBR Green I或者TaqMan探针采用qRT-PCR对RNA进行定量的策略，这些方法具有操作简便、重复性好、敏感度高等优点，多种siRNA定量方法也基于该原理。

3.1.1 引物延长定量PCR(Primer-Extension quantitative PCR，PE-qPCR)PE-qPCR方法依赖于RNA到cDNA的反转录过程，该方法包括两步反应:第一步反转录，即将siRNA反转录成cDNA，该反转录过程使用一个基因特异性引物(gene-specific primer，GSP)，该引物由基因特异区和延长区两部分组成，可以将siRNA反转录成cDNA，同时引入一个万能PCR结合位点将cDNA链延长;第二步荧光定量PCR，在第一个循环中，使用含有2'-O，4'-C亚甲基化桥(methylene brigde)的锁定核酸序列(locked nucleic acids，LNA)作为反向引物对cDNA进行扩增，在随后的反应循环中，万能引物作为正向引物和LNA-R作为反向引物进行扩增反应，通过检测SYBR Green的荧光信号对siRNA进行定量。这种方法可以在106～107范围内对siRNA的浓度进行检测，能够区分有微小序列差异的 siRNA［3］。

该方法通过使用基因特异性引物延长cDNA的长度有利于对小分子siRNA的检测，而LNA中的2'-O，4'-C亚甲基化桥可以稳定糖基，增加寡核苷酸的杂交亲和力。

但是，该方法在荧光定量前需将siRNA反转录成cDNA，在提取siRNA和反转录的过程中不可避免的会造成siRNA的降解和损失，因此会造成测定浓度比实际浓度低的情况。并且由于反转录效率的差异，导致该方法的重现性较差。另外，在转录引物LNA-R中引入亚甲基化桥，合成引物较复杂，并且该方法不能区分已降解的和完整的siRNA。

3.1.2 茎环反转录PCR(Stem-loop RT-PCR) Stem-loop RT-PCR方法同样包括两步反应。在第一步反转录过程中使用Stem-loop反转录引物，该引物形成一个茎环结构可以结合到小核苷酸片段的3'末端，对其进行反转录，这种茎环引物在反转录效率和特异性方面都优于传统引物;在第二步荧光定量PCR反应中加入基因特异性的上游引物、下游引物以及特异性的TaqMan探针进行PCR反应，Taqman探针对于siRNA是特异的，并且能够区分出一个核苷酸之差的siRNA，不受基因组DNA污染的影响，反应过程中通过检测TaqMan探针的荧光值变化来定量小核苷酸。该方法具有高敏感性、高特异性、高精确性的特点，并且，无需对核酸进行纯化就可对单个细胞进行直接分析［4］。

该方法使用TaqMan探针，特异性好，背景干扰较低，并且能够区分出已降解的siRNA和完整的siRNA，通过使用Taqman探针，能够检测不同的siRNA，节省了时间和费用，具有较高的特异性、敏感性、和精确性;使用茎环结构的反转录引物延长了cDNA，有利于对小片段siRNA的检测，并且该方法较为简单、快捷。但该方法也需要经过反转录步骤，反转录效率的差异将会导致siRNA定量的不准确。

3.1.3 小目标定量PCR(Small-target Quantitative PCR，SQPCR)SQPCR方法首先使用T4 DNA连接酶将两个与小核苷酸片段部分配对的片段连接起来。然后使用一个包含M13 Fwd的上游引物和包含M13 Rev的下游引物位点的5'寡核苷酸和3'寡核苷酸对连接片段进行扩增［5］。这种形式的2个酶连片段可对任何长短的核酸片段进行检测和定量，具有强大的应用范围。

该方法通过将两个片段连接起来以延长核酸片段的长度，有利于检测的进行。这种方法具有广谱性，两个酶连片段的序列只需达到连接部分与siRNA序列互补，对于不同siRNA的检测，只需改动两个片段中与siRNA互补的地方即可，通用引物M13 Fwd/M13 Rev可对不同的序列进行检测和定量。

但是这个方法不能区分已降解的siRNA和完整的siRNA，并且由于需要连接酶进行连接，对于过程中的连接效率无法进行定量，连接效率的差异会对PCR结果产生很大的误差，导致该方法的重复性差。

3.1.4 弯曲发夹方法(Crook Hairpins)Crook Hairpins方法检测的siRNA需要在3'端连接上一段DNA，这段siRNADNA结构既可作为功能基因引发mRNA的沉默又可作为PCR扩增的引物，用于siRNA的定量检测［6］。并且siRNA 3'端DNA末端能够形成茎环结构可以防止核酸酶对siRNA的降解。该方法需要构建一个与siRNA互补配对的质粒作为模板，利用样品中未知的siRNA作为“上游引物”进行PCR反应，由于加入的下游引物和质粒模板是过量的，扩增片段的多少与“上游引物”即siRNA的量成正比，通过检测产物量的变化就能对siRNA进行定量。

siRNA-DNA结构可以作为PCR扩增的“引物”，省去了反转录步骤，具有较好的特异性、重现性，使用该方法可以对siRNA进行准确的定量。但缺点是方法较复杂，需对siRNA进行特殊修饰(连接一段DNA序列)以及构建质粒模板。

3.1.5 竞争定量PCR(Competitive Quantitative PCR，cqPCR)

cqPCR使用siRNA与同源性的DNA引物竞争模板DNA，siRNA结合到模板上后可阻止扩增反应。在Taq酶的作用下，3'端被2'-O-甲基化酶修饰的siRNA不能作为引物参与DNA的延伸。siRNA作为竞争引物，在其最低浓度为6.25 nmol/L时，模板DNA和 Ct值(Threshold Cycle，实测荧光值达到设定值时的PCR循环数)之间呈较好的线性关系，在这种条件下，加入序列特异性siRNA可使Ct值呈现siRNA剂量依赖性线性增加，因此，能够通过Ct值的变化来定量siRNA。2'-O-甲基化酶修饰的 siRNA在血清中可阻止模板的复制，没有修饰过的siRNA、被核酸酶降解的或是错配的siRNA都不能阻止模板的复制，这就保证了siRNA的序列特异性，并能够区分降解的和非降解的siRNA序列［7］。

cqPCR不需RNA反转录为cDNA的过程，避免操作过程中造成的损失，并可鉴定完整的siRNA;cqPCR避免了因为siRNA太小给传统qPCR带来的弊端，它是用竞争引物与模板的结合来定量而不是利用模板的拷贝数来定量，具有很好的特异性和准确性，可对siRNA进行准确定量。

但是该方法需要对条件进行优化，如模板DNA的量、上游引物的浓度及退火、延伸温度等。

3.2 侵入检测(Invader Assay)

侵入检测方法依赖于目标小核苷酸片段、探针和invasive oligo(侵入寡聚核苷酸)之间形成一个重叠的结构，探针和invasive oligo分别与siRNA部分互补，相交处部分重叠，形成一个结构特异性酶的的识别位点，通过该酶的切割，探针释放出一段5'-flap。在第二步反应中，首先加入捕获核苷酸(Arrestor oligo)，结合第一步反应中未参与反应的探针，以防探针结合到第二个反应模板上，随后加入第二个反应模板和FRET(fluorescence resonance energy transfer，荧光共振能量转移)寡核苷酸片段，第一步反应释放的5'-flap能够与第二个反应模板和FRET寡核苷酸片段形成与第一步反应相同的结构，通过酶的作用释放出FRET寡核苷酸片段上的荧光信号，通过对荧光信号的检测来定量小核苷酸片段。该方法可以区分出一个核苷酸之差的小核苷酸片段，并且在细胞裂解液中使用荧光检测只需2～3 h的孵化时间[8]。

侵入检测方法的优点是敏感性好，只需少量siRNA就可以对siRNA进行定量，并可以区分出一个核苷酸之差的siRNA，同时该方法较快捷，反应只需2～3 h的孵化时间。但是该方法需要两次酶切，两步反应受到多方面因素的影响，均需要确定反应的最佳条件，由于酶切效率的差异，会造成结果失真，影响siRNA的定量，且该方法需要合成不同的寡核苷酸片段用于检测，过程复杂。

3.3 ELISA定量检测法

ELISA定量检测法首先对siRNA进行标记，siRNA正义链5'端标记上生物素作为捕获标记，反义链5'端标记上二硝基酚(DNP)作为检测标记。细胞裂解液或是血清中标记的双链定量siRNA(double-stranded QsiRNAs，dsQsiRNA)使用磷酸盐缓冲液进行稀释，然后将siRNA孵化在链霉素包被的96孔板中，逐次加入一抗、辣根过氧化物酶标记的二抗孵育，最后加入底物(TMB)并终止反应，通过对底物的荧光检测来反映siRNA的量。该方法的线性范围在10～100 fmol/mL，灵敏度很高(最低检测限度5.4 fmol/mL)，比荧光定量方法的敏感度高629倍。在单链siRNA存在的条件下，它的检测信号的强度可降低到本底水平，具有灵敏度高，背景干扰弱，特异性强，重现性较好等优点，并可对完整的双链siRNA进行定量。实验结果表明以ELISA为基础的定量法可用于评估化学修饰的siRNA和阳离子载体系统，尤其是在药物动力学方面有较大的前景［9］。但是该方法的影响因素很多，如固相载体、洗涤剂与稀释剂、底物等，容易造成结果失真;且体外化学合成的siRNA双链均需要荧光标记，合成修饰的费用昂贵，且修饰后的siRNA对其功能是否有影响仍不得而知。

4 讨论

siRNA能够引发RNAi程序，干扰特异基因的表达的特点，使其成为国内外药物研发的新热点，但siRNA只有20～25个碱基，利用传统的PCR方法引物难以结合进行扩增，对于检测和定量来说都是很大的挑战;并且siRNA作为药物进入动物或人体后，会被血液中的核酸酶部分或完全降解，如何将完整的siRNA和不完整的siRNA区分开来，以及如何对完整的siRNA进行准确的定量是siRNA药物药代动力学研究和药物研发中的难题。目前，已报道了多种定量siRNA的方法，但这些定量方法应用于siRNA检测各有利弊。

siRNA药物的制备方法不同，其适用的检测方法也不同。最常见siRNA制备方法是体内载体表达和体外化学合成修饰，对于通过体内载体表达的方法，其在血液中是以载体的形式存在，对于其药代动力学检测则可使用传统的荧光定量PCR方法;而对于化学合成的siRNA在血液中表现上述特点，因此，其检测方法需要进一步讨论。

根据定量时是否将siRNA反转录成cDNA可以将定量方法分为两类，一类需要将siRNA反转录成cDNA然后进行定量;另一类是对siRNA直接进行定量。PE-qPCR和Stemloop RT-PCR法属于第一类定量方法。由于在提取siRNA和反转录的过程中不可避免的会造成siRNA的降解和损失，因此，会造成测定浓度比实际浓度低，对于含微量siRNA的血液样品，该类方法可能由于损失而造成检测结果失真。

另外几种方法中侵入检测方法使用切割酶对特异性位点进行切割，由于酶切效率的影响不可避免的会造成定量的不准确性。与侵入检测方法类似，Ligation Assay中用到了连接酶，对于连接过程中的连接效率无法估算，也存在定量不准确、重复性差的问题。

Crook Hairpins方法使用了siRNA-DNA结构，该结构既可以作为功能基因引发mRNA的沉默又可以作为PCR扩增的引物，在这种方法中siRNA是作为“引物”，根据扩增产物的量来直接对其进行定量，但其需要对siRNA进行特殊修饰，过程复杂，且在实际应用中，这种siRNA-DNA片段是否具有功能还需讨论。

ELISA定量检测法与PCR法和侵入检测方法不同的是，它对siRNA进行了双标记，然后利用抗体的特异性结合以及酶对底物的高效生物催化作用对极微量的siRNA双链进行定量检测。ELISA定量检测法的灵敏度明显高于荧光定量方法。但是由于ELISA过程会受到很多因素的影响，如固相载体、洗涤剂与稀释剂、底物等，每一个环节出了差错都会影响定量结果，所以很容易造成结果的失真，并且对于siRNA标记后在体内是否能起抑制作用仍需证实。

cqPCR法与Crook Hairpins方法类似，在该方法中siRNA虽然不能作为引物诱导DNA的扩增，但是却使用siRNA与同源性的DNA引物竞争模板DNA，siRNA结合到模板上后可阻止PCR扩增反应的进行，用间接竞争法来进行siRNA的定量。该方法不经过反转录过程，避免了提取和反转录过程造成的损失和误差，且该方法检测的灵敏度高，并可使用血清样品直接检测，定量过程简便，同时还可区分出完整的和降解的siRNA。

除上述介绍的方法之外，文献还报道其它用于siRNA定量的方法。Northen Blot是检测和定量RNA的常用方法，但是Nothern Blot反应过程复杂，要求条件严格，且该方法的灵敏度低，定量精度低，因此，认为该方法并不适用于血液中的微量siRNA药物的精确定量检测。而Microarray和基于Microarray(如mirMASA［10］)的一些方法适用于 siRNA的高通量检测，但这类方法存在反应条件难以控制、选择性不够以及反应灵敏度低的问题。其它方法，例如Signal-amplifying Ribozymes(信号放大核酶法)［11］，通过设计对目标有活性的核酶，使其与5'端标记为荧光基团，3'端标记为淬灭基团的小核苷酸片段的片段反应，经过核酶酶切后释放出荧光信号，经过对荧光信号强度的检测来定量小核苷酸片段。该方法灵敏度高，能够区别出完整的和已降解的siRNA序列。但是该方法需要设计有活性、并且特异性针对siRNA的核酶，过程复杂，操作困难;而且siRNA需要标记荧光基团和淬灭基团，价格昂贵，并且可能影响其在体内的抑制活性。

综上所述，在这些siRNA定量方法中，cqPCR方法相对于其它方法更为简单、方便、实用，该方法的敏感度高、重复性好、且能够特异的检测出生物样品中完整的双链siRNA和降解的siRNA，siRNA本身不需要特别的修饰，是应用于siRNA药代动力学检测较为理想的方法。但是，如何建立一个特异性好、敏感性强的siRNA药代动力学定量方法，用于完整有功能的siRNA检测，仍需要我们不断摸索完善。

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