非血体液的γ－干扰素释放检测对结核感染的诊断价值

魏 娟综述，汪芳裕审校

(本文编辑:张仲书)

随着经济水平提高，卫生条件改善，我国结核病的发病率有所下降，但结核感染的临床表现也越来越不典型，为临床诊治带来困难。对于接种过卡介苗、非结核杆菌感染、免疫缺陷人群，结核皮肤试验(tuberculin skin test，TST)的临床诊断能力有限;对于潜在结核感染及细菌培养阴性的活动性结核患者来说，也无检测的“金标准”，临床上确诊结核杆菌感染也比较困难，因此需要敏感性、特异性更佳的新诊断方法。

1 γ－干扰素释放检测(interferon gamma release assays，IGRAs)

1.1 IGRAs的定义 2001年美国食品药品管理局(FDA)［1］将 IGRAs的第一代 Quanti FERON 结核检测试验(Quanti FERON－TB test，QFT)作为结核感染的诊断方法之一，在这之前仅有结核皮肤试验广泛地作为结核感染诊断的免疫试验。在发达国家，外周血IGRAs被应用于结核感染诊断中，但外周血IGRAs尚不能鉴别潜在性与活动性结核感染。有报道在活动性肺结核患者中，T细胞同源扩散能被招募至感染部位［2］，因此通过酶联免疫斑点试验(enzymelinked immunospotassay，ELISPOT) 的方法，对感染局部的效应T细胞进行计数，在提高活动性肺结核诊断的特异性方面优于外周血。目前国内外针对结核感染局部的非血性体液进行的IGRAs研究，可能有助于提高结核感染诊断的敏感性及特异性。

1.2 IGRAs的分类 γ－干扰素 (IFN－γ)在调节细胞介导的免疫反应中起重要作用，故IGRAs通过检测结核特异抗原诱导T细胞释放IFN－γ来评估结核感染。第一代 IGRAs［3］是 Quanti FERON－结核试验(Quanti FERON－TB test，QFT)，2001年由 FDA 允许作为诊断结核感染的方法之一，这是利用酶联免疫法(ELISA)检测由结核纯蛋白衍生物(purified protein derivative，PPD)刺激所产生的 IFN－γ的量。第二代 IGRAs［4］是 QFT 胶体金试验(QuantiFERON－TB gold test，QFT－G)，利用结核特异性抗原即早期分泌的抗 原 靶 点 6(early secretory antigenic target－6，ESAT－6)和培养滤过蛋白10(culture filtrate protein 10，CFP－10)刺激 IFN－γ 释放的检测。2007年第三代IGRAs诞生［5］，即QFT胶体金试管内试验(Quanti FERON－TB gold in－tube test，QFT－GIT)，将预置有肝素、葡萄糖、植物素的试管加入混有试剂的外周血，并与结核特异抗原孵育，判断对结核特异抗原的反应。2008年7月，FDA 认定第四代 IGRAs［5］，即结核感染T细胞酶联免疫斑点法(T－ELISPOT tuberculosis，T－SPOT.TB)，实验通过结核特异抗原即 ESAT－6和 CFP－10和外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)共同孵育，通过ELISPOT检测分泌IFN－γ的细胞数来评估结核感染，其中每个斑点代表一个与相应抗原反应的T淋巴细胞。

1.3 外周血IGRAs诊断结核感染的价值评价 有研究［6］表明在培养阳性的活动性结核感染人群中，评价 QFT－GIT的阳性和阴性人数，其敏感性为81%。有研究［7－9］表明在培养阳性的活动性结核感染人群中，评价T－SPOT.TB的阳性以及阴性人数，其敏感性为91%。在比较T－SPOT.TB和TST试验的敏感性研究中，T－SPOT.TB敏感性是90%，TST敏感性是89%。研究表明［7，11］在不可能感染结核的人群中，QFT－GIT特异性是99%，TST特异性是85%，TST 的特异性明显比 QFT－GIT 和 T－SPOT.TB低，TST假阳性的结果，可能因卡介苗(Bacillus Calmette－Guerin，BCG)接种或暴露于非结核菌所致。

目前研究发现，无论是 TST，还是外周血的IGRAs，都不能准确地鉴别潜在结核感染、活动性感染以及抗痨治疗后的感染。急性感染期间，有活性的T细胞主要积聚在炎症反应局部以对抗感染，故外周血中的效应T细胞所占比例较少，研究炎症局部的效应T细胞的数量对诊断活动性结核疾病可能更有意义。

2 非血体液的IGRAs诊断结核的价值

2.1 胸腔积液和支气管肺泡灌洗液 Wilkinson等［12］将10例结核患者的结核性胸腔积液浓缩后，测出其中T细胞比外周血的高15倍(标准差为6倍)，同时行体外T－SPOT.TB分析，结果提示胸腔积液中ESAT－6抗原特异的T细胞数量明显高于外周血，可为结核性胸膜炎诊断提供新方法。2006年某个案报道［13］一名64岁德国老年女性，既往有克罗恩病史，近期应用了他克莫司、氢化可的松、骁悉、英夫利昔等免疫抑制药物，因胸腔积液就诊，结核菌培养阴性。胸腔积液以及肺泡灌洗液、胸膜活检、胸腔镜活检均未检出抗酸杆菌。仅在胸膜病理活检提示干酪样肉芽肿，对外周血以及胸腔积液行T－SPOT.TB检测，发现每250 000 PBMCs中含有104个ESAT－6特异T细胞，39个CFP－10特异T细胞;肺泡灌洗液中每250 000细胞中含178个ESAT－6特异T细胞，63个CFP－10特异T细胞，明显高于外周血，经胸膜组织活检的结核特异PCR证实了结核感染，经2周的抗痨治疗后患者胸腔积液消失。说明即使患者在可能有免疫抑制的情况下，T－SPOT.TB对诊断活动性结核性胸膜炎也着重要作用，尤其是感染局部，对胸腔积液细胞的敏感性优于外周血2009年有研究［14］也发现肺结核感染患者肺泡灌洗液含有一定量的结核抗原特异性T反应细胞。Jafari等［10］对37例疑似肺结核患者进行研究，其中12例为痰涂片抗酸杆菌阴性的肺结核患者，25例为非肺结核患者。在12例肺结核患者中，每200 000 PBMCs中含有17 个 ESAT－6 特异 T 细胞，24.5 个 CFP－10 特异T细胞，在肺泡灌洗液中每200 000 PBMCs中含有含有37.5个 ESAT－6 特异 T 细胞，49.5 个 CFP－10特异T细胞;在对照组即非肺结核组中，每200 000 PBMCs中含有1个 ESAT－6特异 T细胞，1个 CFP－10特异T细胞，而在对照组的肺泡灌洗液中无活性细胞(P＜0.01)。此研究表明了，痰涂片抗酸杆菌阴性的肺结核患者，通过肺泡灌洗液中特异细胞的鉴定有助于准确诊断。2007年欧洲结核联合机构组织了由4个研究中心参与的研究［15］，即选取20例具有临床表现或影像学检查怀疑的结核性胸膜炎患者为研究组，21例非结核所致的胸腔积液患者为对照组，对患者的 PBMCs及胸腔积液单核细胞(pleural effusionmononuclear cells，PEMCs)分别进行T－SPOT.TB检查。研究组中有18例 PBMCs的 TSPOT.TB阳性，占 90%;而有 19例 PEMCs的 TSPOT.TB阳性，占95%。在对照组中有7例PBMCs的T－SPOT.TB检测阳性，占33%，而有5例PEMCs T－SPOT.TB 阳性，占 23%。PEMCs 的 T－SPOT.TB对于诊断活动性结核性胸膜炎的敏感性以及特异性分别是95%和76%，皆明显优于外周血。PEMCs中结核感染特异性细胞的计数在临床上简易可行，更有利于结核性胸膜炎的快速而准确的诊断。Dheda等［16］以91例疑似结核感染的南非患者为研究对象，利用 ESAT－6、CFP－10、血凝素作为刺激抗原，通过 T－SPOT.TB、QFT－GIT 的方法进行比较，结果提示，在明确诊断肺结核患者中T－SPOT.TB阳性率(58%)比痰涂法(29%)更高，血凝素和PPD刺激反应作用较差，说明肺泡灌洗液细胞在结核特异抗原刺激下的IFN－γ反应有助于快速诊断结核。

但同时有结果相悖的报道，2008年Chegou等［17］选取66例不明原因胸腔积液患者，抽取患者外周血和胸腔积液的样本进行游离IFN－γ水平检测和QFT－GIT，比较两者在结核诊断中的价值，结果提示，胸腔积液中游离IFN－γ水平是诊断结核性胸膜炎的更为准确的生物标记，优于QFT－GIT。2009年Dheda等［18］选取南非78例疑似结核性胸膜炎所致的胸腔积液病例为研究对象，结果提示未行刺激的胸腔积液中IFN－γ水平的检测对于结核感染的诊断更加精确，通过检测特异性抗原刺激局部的T细胞IFN－γ分泌并不能增加其诊断价值。2009年Hooper等［19］综述既往研究，认为IGRAs比直接检测胸腔积液中特征性的标记物更加复杂和昂贵，检测的结果多有波动，不稳定，且不能排除活动性结核感染。2010年Krenke等［20］认为，目前在活动性结核性胸膜炎的诊断中，无肯定的证据证明IGRAs诊断价值优于胸腔积液中腺苷脱氨酶和IFN－γ水平检测。

2.2 脑膜炎脑脊液的IGRAs 结核性脑膜炎患者中软脑膜是结核感染的局部炎症部位，其脑脊液可通过穿刺途径获得，故通过对脑脊液的分析，诊断结核感染是可行的。有报道［21］称11例疑似结核性脑膜炎患者中，9例脑脊液的T－SPOT.TB具有很高的T细胞反应。以上研究提示脑脊液T－SPOT.TB具有较高的敏感性。2008年Luca等［22］研究比较了外周血和脑脊液的QTF在诊断结核性脑膜炎中价值，发现全血中QTF的敏感性为78.57%，QTF在脑脊液中的特异性高于血，阳性预测率超过90%。脑脊液的QTF比脑脊液细菌培养速度更快，敏感性更高，是诊断结核性脑膜炎的好方法。2008年Kim等［23］以37例中枢神经系统结核患者为研究对象，发现PBMCs的 T－SPOT.TB的敏感性、特异性分别为91%和63%，而脑脊液T－SPOT.TB的敏感性和特异性均为75%。此报道提示脑脊液T－SPOT.TB在诊断结核性脑膜炎中具有很高的特异性，PBMCs和脑脊液T－SPOT.TB检查能提高中枢神经系统结核感染的准确性。2010年Patel等［24］证明，利用脑脊液中单核细胞的结核特异抗原刺激的 T－SPOT.TB，在诊断结核感染方面具有快速准确的特点。但是 Méndez Echevarría 等［25］指出 QFT－GIT 在某个患有结核性脑膜炎的儿童的诊断上缺乏敏感性。

2.3 腹水的IGRAs 2009年我国协和医院张丽帆等［26］报道，利用结核特异抗原刺激外周血、胸腹水、脑脊液的单核细胞，计数释放IFN－γ特异性T细胞，发现腹水中斑点形成细胞数是外周血的31.9倍。与PBMCs的 T－SPOT.TB相比，腹水中的检测可能更准确地诊断腹膜结核感染。Lorenz等［27］报道某20岁女性，因腹水、乏力、盗汗、低热等症状入院，痰涂片抗酸杆菌阴性，腹水和粪便结核PCR阴性，而腹水和PBMCs的QFT－G阳性。腹膜活检标本的细菌培养阳性和诊断性抗痨治疗证实患者为结核性腹膜炎，说明了腹水的QFT－G对诊断结核性腹水有一定的诊断价值。

3 结语

结核杆菌培养周期长，尽管国内有报道［28］经皮穿刺腹膜活检结核明确诊断率为30.8%，但结核感染组织活检标本收集仍有难度，且抗酸杆菌检测阳性率低，结核的PCR检测易污染、费用高，多种因素导致临床上结核感染诊断困难。目前在国际上外周血的IGRAs已是诊断结核感染的常用方法。结核感染时，有活性的T细胞主要积聚在炎症反应局部如胸腔积液、支气管肺泡灌洗液、腹水、脑脊液、肠道灌洗液，这些标本较易获得，故计数其中效应T细胞对诊断活动性结核疾病显得更有意义，有利于准确诊断结核感染。但目前国内外针对非血性体液IGRAs研究样本量偏小，代表性不强，其真正的诊断准确度尚无定论，且与外周血IGRAs比较，其阳性的界定点尚需要统一，试验结果假阳性代表何意义尚不明了。故需要大样本多中心的研究，试验方法也应标准化、统一化，为迅速准确地诊断结核感染提供帮助。

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