棉粕中游离棉酚含量的测定方法

王开丽，张石蕊

（湖南农业大学动物科技学院，长沙 410128）

棉籽饼粕是一种营养丰富的蛋白质原料，其含有蛋白质约40%、赖氨酸1.59%和蛋氨酸0.52%，一直作为蛋白质饲料用于畜禽养殖业中，可在一定程度上替代豆粕等常规蛋白质原料，弥补蛋白质饲料资源的不足[1]。但是有毒物质棉酚的存在限制了棉籽饼粕的大量使用。棉酚存在于棉籽色素腺体中，棉籽脱壳榨油后仍有部分棉酚残留于棉籽粕中，若食用过量则会使动物中毒，甚至造成死亡。棉酚按存在形式可分为游离棉酚（FGP）和结合棉酚（UGP）两种，两者之和称为总棉酚（TGP）。游离棉酚对动物有毒，因为其含有的活性基团羟基和醛基未被封闭，而结合棉酚的活性基团已与蛋白质、磷脂、氨基酸等结合，对动物没有毒性[2]。鉴于棉籽饼粕中游离棉酚有害，国家制定了游离棉酚的饲料卫生标准，于1992年4月作为强制性标准颁布实施。饲料中游离棉酚允许量见附表。

附表 游离棉酚的允许量（GB 13078—2001）mg·kg-1

目前采用的棉籽饼粕去毒的方法是在棉籽饼粕中按其游离棉酚的含量来决定加入FeSO4的用量。其比例规定为游离棉酚∶FeSO4=1∶1。因此检测棉籽饼中游离棉酚的含量是合理利用棉籽饼的一个重要技术指标。对游离棉酚的测定方法也多种多样，目前已报道的游离棉酚检测方法主要有比色法、紫外分光度法（UV）、高效液相色谱法（HPLC）和原子吸收分光光谱法（AAS）等，其中对饲料中游离棉酚的检测以苯胺法和HPLC法使用最为普遍。

1 比色法

比色法有苯胺法、甲氧基苯胺法、三氯化锑（SbCl3）法、间苯三酚法等。目前中国普遍使用的方法是苯胺法。

1.1 苯胺法

国标苯胺法是国家饲料卫生标准规定的方法，测定棉籽饼粕及其配合饲料中的游离棉酚含量均可采用此方法。苯胺法又可分为国标苯胺法（GB13086—91）、AOCS苯胺法（Ba7－58）（美国油化学家学会官方方法）和Smith苯胺比色法，这3种苯胺法分别以不同溶剂提取棉酚，用苯胺显色后进行比色测定。国标苯胺法的测定原理是在3－氨基－1－丙醇存在下，用异丙醇与正己烷的混合溶剂（3∶2，V∶V）提取游离棉酚，加入苯胺与棉酚结合为苯胺棉酚，在最大吸收波长440 nm处进行比色测定。测定之前先配制异丙醇与正己烷的混合溶剂（3∶2，V∶V）和溶剂A（取异丙醇500 mL、正己烷混合溶剂、3－氨基－l－丙醇2 mL、冰乙酸8 mL和水50 mL，放入1 000 mL容量瓶中，再用异丙醇、正己烷混合溶剂定容）。具体操作步骤参照GB/T13086—1991。

AOCS Ba7－58法是美国油化学家学会（AOCS）官方方法，AOCS明确定义为凡能被70%丙酮水溶液提取的棉酚及其衍生物统称为“游离棉酚”。该方法的原理是在适当的试验条件下，用70%丙酮水溶液提取棉酚，棉酚与苯胺作用可生成黄色的二苯胺棉酚，分别测定苯胺棉酚和棉酚的吸光度，两者之间的关系见式1。

式中：F为换算因子，在波长一定的条件下为常数；C为溶液中待测的游离棉酚的含量，单位mg；b、a分别为溶液中苯胺棉酚和棉酚的吸光度。

此式是根据朗伯－比尔定律A=￡bc推导而来。试验先利用棉酚标样（100%）配制一系列浓度的棉酚标液，该标液中游离棉酚的含量C是可计算得到，再通过测定标准棉酚的b－a值，利用式（1）求得换算因子F的平均值，然后测定待测溶液的棉酚和苯胺棉酚的吸光度a、b，得到b－a值，再将数据代入式（1），从而得到待测溶液中棉酚的含量，此法即为标准曲线法。

Smith苯胺比色法的原理与苯胺法相同。提取液为溶液A（乙醇715 mL，用水稀释至1 000 mL，加冰乙酸0.2 mL及乙醚200 mL）。

游离棉酚及其衍生物的结构式中含有醛基和羟基，醛邻位的酚羟基活性强，易与动物体内的蛋白质、氨基酸、磷脂等反应，造成动物机体功能紊乱，产生毒性作用。对于棉籽饼粕饲料的安全检测应反映出样品中有毒物质的含量，所以检测结果应包含棉酚及其衍生物。而苯胺法对棉酚的检测就是利用醛邻位的酚羟基与苯胺发生反应，生成的二苯胺棉酚在一定波长处有最大吸收峰，利用分光光度计测吸收值得到校正吸光度A，代入计算公式即得游离棉酚含量。该方法的检测结果就包含棉酚和含有活性酚羟基的棉酚衍生物。所以用苯胺法检测饲料中的棉酚含量更合适，这种方法比较可靠，但是操作步骤繁琐、耗时，不适合大批量样品检测，并且苯胺毒性大，操作中要特别小心，长期接触苯胺，很容易对操作人员造成伤害，苯胺不稳定，易氧化由无色变为黄色、棕色、直至红棕色，从而使空白试验吸收值升高，需重新进行蒸馏。周天兵等对AOCS苯胺法和国标苯胺法对常规棉粕的检测结果进行了比较，结果表明，AOCS苯胺法用丙酮70%的提取棉酚及其衍生物较充分，测定值重复间差异小，结果稳定，而国标苯胺法对棉酚及其衍生物的提取效果相对较差，结果不稳定，重复性较差、建议可用AOCS苯胺法代替国标苯胺法检测饲料中游离棉酚含量[3]。

1.2 三氯化锑法

三氯化锑法的原理是在氯仿溶液环境下，游离棉酚与SbCl3反应生成一种红色络合物，此络合物在500～520 nm处有最大吸收峰，利用吸光度在一定范围内符合比尔定律进行比色测定[4]。但因SbCl3遇水易生成浑浊沉淀，操作需严格细致，稍不注意就会使比色液浑浊，导致分析失败，且灵敏度较差。此法对试样中棉酚的含量也有所限制，当样品中的棉酚含量＞0.045%，会影响结果的准确性。

1.3 间苯三酚法

间苯三酚法是利用样液中的棉酚和间苯三酚在弱酸性溶液中（＞6 moL盐酸溶液）生成有色络合物，络合物的最大吸收峰在550 nm，颜色深浅与含量成正比而进行比色测定。该法简便、灵敏度高，分析速度高于苯胺法，是目前常用的快速分析方法。原间苯三酚法的溶剂抽提系统采用丁酮一水恒沸液加少量苯胺（90+10+0.5）的混合溶液，因苯胺与丁酮一水恒沸液互溶性很差，极不稳定，易产生浑浊现象，造成提取液不稳定，且制备恒沸溶液麻烦[5]。为克服这一缺陷，有学者改良了间苯三酚法，采用丙酮70%作为抽提液，同时缩短了抽提时间，灵敏度可达0.1 μg·25 mL－1（原方法的灵敏度为0.006 mg·25 mL－1），线性范围0～160 μg·25 mL－1（原方法线性范围是 0～100 μg·25 mL－1）。改良方法不仅克服了抽提液不稳定的问题，也进一步提高了分析速度和检测灵敏度，且线性范围加宽。

2 紫外分光光度法

紫外分光光度法（UV）是食品行业检测棉籽油中的游离棉酚含量的国标法，也可用于测定饲料中的棉酚含量。该法用70%丙酮溶液提取样品中的棉酚，提取液在378 nm波长处有最大吸收峰，其吸收值与棉酚量在一定范围内成正比，与标准系列比较可得游离棉酚含量[6]。UV法所需仪器设备少、操作简单易行，但由于是直接测定样品溶液的吸光度，没有参比溶液作对照，使得样品中存在的干扰物质没有被分离，因此，UV法得到的结果一般偏高[7]。

3 高效液相色谱法

高效液相色谱法（HPLC）的分离原理是当液体流动相所携带的混合物流过固定相时，就会和固定相发生力的作用，混合物中各组分在性质和结构上有差异，与固定相发生作用的大小也有差异，因此，在同一推动力作用下，不同组分在固定相中的停留时间长短不同，从而按不同次序从固定相中流出，达到分离效果。待分离物质即使结构非常相似，都具有不同的停留时间，只要选择好合适的分离条件，就可以利用HPLC法将其成功分离出来，结构类似物之间不受干扰。HPLC法的理论价值是通过选用合适的分离条件分离出纯棉酚，能比较真实地反应样品中的棉酚水平。但是由于棉酚分子结构中含有6个羟基和两个醛基，性质很不稳定，很容易发生反应产生结构相似的棉酚类似物。

目前关于HPLC法的报道较多，主要由于色谱柱、流动相和萃取剂的选择的不同使得操作方法以及测定结果的稳定性较差。张延坤等检测结果表明，线性范围为2～10 μg，最低检出量为10 ng[8]。吴伟伟等试验结果表明，棉酚的最低检出浓度为0.94 mg·kg－1，平均回收率为96.23%～99.36%，RSD为3.24%～4.02%[9]。

4 原子吸收光谱法

目前用原子吸收光谱法（AAS）测游离棉酚的报道很少，主要是没有明确的空心阴极灯或无极放电灯做电源，无法实现AAS测定。董仕林等报道，以镍元素灯为光源用原子吸收仪测棉籽油中的游离棉酚含量，用丙酮70%萃取试样中的游离棉酚，以4 mA电流、0.15 mm狭缝等条件测定游离棉酚，试验结果与紫外分光光度法测得结果无显著性差异（P＜0.05）[10]。

5 小 结

测定棉酚含量有多种方法，各种方法的测定结果都能反映出样品间棉酚的相对水平，研究者应根据棉粕的加工用途和实际条件等具体情况选择适合的分析方法。

[1]贺秀媛,李玉峰.棉籽饼粕饲料中游离棉酚测定方法的研究[J].中国畜牧杂志,2008,44（12）:60－62.

[2]张文举.高效降解棉酚菌种的选育及棉籽饼粕生物发酵的研究[D].杭州:浙江大学,2006.

[3]周天兵,宋代军,李爱科.两种游离棉酚检测方法对常规棉粕检测的比较[J].畜牧与饲料科学,2011,32（2）:14－16.

[4]叶世柏.化学性食品中毒与检验[M].北京:北京大学出版社,1989.

[5]郑清梅,温茹淑,韩春艳.间苯三酚法快速测定棉粕中游离棉酚的方法研究[J].饲料工业,2010,31（3）:42－44.

[6]黄永林,阮俊.棉籽中游离棉酚的含量测定[J].广西植物,2001,21（4）:371－373.

[7]杨伟华,冯新爱,戚廷香,等.几种测定游离棉酚方法的比较[J].中国棉花,1995,22（2）:13－14.

[8]张延坤,房玉水,邓峰,等.用高效液相色谱法（HPLC）测定棉籽蛋白中的游离和总棉酚[J].营养学报,1995,17（4）:419－424.

[9]吴伟伟,许赣荣.HPLC法测定棉籽饼粕饲料中的游离棉酚[J].河北农业大学学报,2009,32（5）:105－107,118.

[10]董仕林,洪加敏.应用原子吸收法测定游离棉酚[J].中国公共卫生,1993,9（8）:366－367.