LC-MS/MS 同时测定卷烟主流烟气中4 种芳香胺

余晶晶，王，谢复炜，陈玉松，赵 阁，张晓兵

中国烟草总公司郑州烟草研究院，郑州高新技术产业开发区枫杨街2号 450001

芳香胺类化合物在烟叶和烟气中均有分布，但烟气中的含量略高。1-氨基萘、2-氨基萘、3-氨基联苯、4-氨基联苯4种芳香胺被列入Hoffmann名单中［1］，且被国际癌症研究机构（IARC）列为致癌物［2］。目前，芳香胺化合物的检测方法主要有气相色谱法［3-4］、液相色谱法［5-7］、毛细管电泳法［8］、气相色谱-质谱联用（GC/MS）［9-11］、液相色谱-质谱联用（LC-MS/MS）［12-15］等。GC/MS是分析卷烟主流烟气中主要芳香胺类化合物最常用的手段，相关的国家标准GB/T 23358—2009《卷烟 主流烟气总粒相物中主要芳香胺的测定 气相色谱-质谱联用法》已发布实施。然而，由于烟气样品的基质十分复杂，4种芳香胺化合物含量极低（ng/支），采用GC/MS测定时，样品前处理需要多步液液萃取、浓缩操作，且需要衍生化反应，1次样品前处理约需2 d。LC-MS/MS因具有灵敏度高、选择性好等特点，特别适用于复杂基质中超低含量物质的定量分析，已用于不同基质中芳香胺的测定。Saha等［12］采用LC-MS/MS测定了卷烟主流烟气中的6种芳香胺，但其样品前处理采用液液萃取方式，操作繁琐费时，且未测定4-氨基联苯。因此，采用阳离子交换固相萃取柱对样品进行纯化处理，建立同时测定卷烟主流烟气中4种芳香胺的LC-MS/MS方法，可为卷烟烟气中有害成分分析及卷烟安全性评价提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂和仪器

20种市售卷烟样品。其中1～15为国产烤烟型卷烟，16～18为国产混合型卷烟，19为进口烤烟型卷烟，20为进口混合型卷烟。其盒标烟气焦油、烟碱和CO量如表1所示。

1-氨基萘、2-氨基萘、3-氨基联苯、4-氨基联苯、d7-1-氨基萘、d9-4-氨基联苯（纯度≥98%，上海安谱公司）；甲醇（色谱纯，美国J&T Baker公司）；乙腈（色谱纯，美国Dikma公司）；甲酸（色谱纯，美国Tedia公司）；甲酸铵（色谱纯，美国Alfa Aesar公司）；氨水（AR，美国CNW公司）；盐酸（AR，洛阳市化学试剂厂）。

API5500质谱仪（美国AB SCIEX公司）；Agilent 1200高效液相色谱仪（美国Agilent公司）；SM450直线式吸烟机（英国Cerulean公司）；Milli-Q50超纯水仪（美国Millipore公司）；KQ-700DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；CP2245电子天平（感量：0.0001 g，德国Sartorius公司）；Dikma ProElut PXC固相萃取柱（150 mg/6 mL，美国Dikma公司）；Agilent Bond Elut Plexa PCX固相萃取柱（200 mg/6 mL，美国Agilent公司）；Waters Oasis®MCX固相萃取柱（150 mg/6 mL，美国Waters公司）。

1.2 样品处理与分析

将卷烟样品放置于（22±1）℃，相对湿度为（60±2）%的环境中平衡48 h，然后挑选（平均质量±0.02）g和（平均吸阻 ±49）Pa/支的烟支作为测试烟支。采用直线式吸烟机按照ISO标准条件抽吸卷烟，即每60 s抽吸一口，每口抽吸容量35 mL，抽吸持续时间2 s。用Ø44 mm剑桥滤片捕集卷烟主流烟气总粒相物，每张滤片收集4支或5支卷烟的总粒相物，取收集20支卷烟烟气总粒相物的滤片置于200 mL锥形瓶中，准确加入100 mL 5%（质量分数）HCl和100µL氘代内标标准溶液（d7-1-氨基萘和d9-4-氨基联苯浓度分别为2µg/mL 和 0.4µg/mL），超声萃取30 min，然后用移液管准确移取50 mL萃取液，上样到Dikma ProElut PXC阳离子交换固相萃取柱［使用前用10 mL甲醇和10 mL 5%（体积分数）HCl活化］，依次用10 mL水和10 mL甲醇洗涤，最后用5 mL 5%（体积分数）氨水甲醇溶液洗脱，洗脱液混匀后取样进行LC-MS/MS分析。分析条件为：

色谱柱：Waters Symmetry ShieldTMRP18（150 mm × 2.1 mm i.d.，3.5 μm）；柱温：30 ℃；流动相：A：0.1%（体积分数）甲酸溶液（V/V），B：0.1%（体积分数）甲酸乙腈溶液；洗脱方式：75%A+25%B，等度洗脱；流速：200 μL/min；分析时间：15 min，进样体积10 μL。离子源：电喷雾电离源（ESI）；扫描方式：正离子扫描；检测方式：多反应监测（MRM）；电喷雾电压：4500 V；气帘气压力：206.8 kPa（30 psi）；辅助气 1压力：482.6 kPa（70 psi）；辅助气 2压力：482.6 kPa（70 psi）；离子源温度：500℃；化合物的定量离子对、定性离子对、驻留时间、碰撞能量（CE）及去簇电压（DP）见表2。

表2 各芳香胺的MRM参数①

2 结果与讨论

2.1 液相色谱条件的选择

芳香胺同分异构体结构、性质极为相似，液相色谱分离困难。为实现1-氨基萘、2-氨基萘及3-氨基联苯、4-氨基联苯的液相色谱分离，考察了Agilent Poroshell 120 EC-C18（100 mm×2.1 mm i.d.，2.7 μm）、Agilent Eclipse XDB-C18（50 mm × 2.1 mm i.d.，1.8 μm）、Waters Symmetry ShieldTMRP18（150 mm × 2.1 mm i.d.，3.5 μm）等色谱柱对4种芳香胺的分离效果，结果发现，Waters Symmetry ShieldTMRP18柱能实现4种芳香胺的同时分离，如图1所示。由图2可知，主流烟气样品中4种芳香胺峰型较好，与干扰物能较好分离，可以满足定性、定量分析要求。

图1 4种芳香胺标样的MRM图

图2 卷烟主流烟气样品中4种芳香胺的MRM图

对流动相组成及梯度条件进行了优化。研究表明，流动相组成为75%A（0.1%甲酸溶液）+25%B（0.1%甲酸乙腈溶液），等度洗脱时，两组芳香胺同分异构体可实现基线分离，且出峰完全仅需9 min。流动相中加入一定比例的甲酸有助于芳香胺的离子化，提高质谱响应。此外，考察了色谱柱柱温对4种芳香胺质谱响应的影响，当柱温为20，30，40℃时，质谱响应无显著差异；当柱温为50℃时，质谱响应降低，噪声增大。因此，选择柱温为30℃。

2.2 烟气捕集条件的选择

采用剑桥滤片捕集卷烟主流烟气中的总粒相物；采用2个装有50 mL 5%HCl溶液的吸收瓶串联捕集气相物。分别采用固相萃取柱净化处理后进LC-MS/MS分析，结果表明，两个吸收瓶溶液中均未检出4种芳香胺，可见主流烟气中的4种芳香胺主要分布在总粒相物中。因此，用剑桥滤片捕集主流烟气中的4种芳香胺。

2.3 剑桥滤片萃取条件的优化

采用5%HCl溶液萃取剑桥滤片，考察了超声和振荡萃取2种不同的方式。研究发现，采用振荡萃取时，剑桥滤片容易破碎，在固相萃取过程中，滤片碎末容易堵塞上样管。另外，振荡萃取30 min与超声萃取30 min所测得的4种芳香胺含量接近。因此，实验中选择超声萃取。同时，考察了超声萃取时间的影响，30 min最佳。

2.4 固相萃取条件的确定

芳香胺类化合物为碱性化合物，阳离子交换固相萃取柱对碱性化合物具有高的选择性和灵敏度，适合复杂基质中目标物的除杂和纯化。实验考察了Dikma ProElut PXC，Agilent Bond Elut Plexa PCX和 Waters Oasis®MCX 3种不同厂家生产的阳离子交换固相萃取柱，实验结果表明，采用不同固相萃取柱所测得的结果无明显差异。由于采用Dikma固相萃取柱处理时所需时间最短，故实验中选其进行样品前处理。

烟气样品十分复杂，基质干扰往往会掩盖低浓度目标物的信息。在5%HCl溶液中加入一定量的标样作为模拟样品，以更准确地反映目标分析物在固相萃取过程中的保留及洗脱情况。首先考察固相萃取过程中目标物的保留情况，分别收集上样、淋洗和洗脱等步骤的流出液，LC-MS/MS分析结果表明，流出液中均未检出这4种芳香胺，由此可知在上样和净化过程中4种芳香胺几乎都保留在固相萃取小柱上。为将固相萃取柱上保留的目标分析物完全洗脱下来，考察了洗脱液组成的影响。图3为不同组成的洗脱液洗脱固相萃取柱时，目标分析物被洗脱的比例，由图3可知，采用5%氨水+95%甲醇溶液才能将目标分析物完全洗脱。因此，选择含5%氨水的甲醇作为洗脱溶液。同时，考察了洗脱液体积的影响，同样采用模拟样品进行实验。增大洗脱体积能够保证把目标物尽可能全部洗脱出来，但目标物的浓度也会随着体积增大而降低。实验中分别采用5，10，15，20，25 mL洗脱液进行洗脱。图4为采用不同体积洗脱液洗脱后，4种芳香胺与其相应内标物质谱响应面积比（A/As）。由图4可知，采用5 mL洗脱液洗脱时，即能将待测目标物完全洗脱。因此，选择5 mL洗脱液进行洗脱。

图3 洗脱液组成对芳香胺净化效果的影响

图4 洗脱液体积对芳香胺净化效果的的影响

2.5 工作曲线与检测限

标准储备液配制。准确称取100 mg 1-氨基萘、50 mg 2-氨基萘、20 mg 3-氨基联苯和10 mg 4-氨基联苯，分别置于100 mL棕色容量瓶中，用甲醇定容，则1-氨基萘、2-氨基萘、3-氨基联苯和4-氨基联苯标准储备液的浓度分别为1.0，0.5，0.2和0.1 mg/mL。该标准储备溶液于-18℃下避光保存，有效期为3个月。一级混合标准溶液配制：分别移取1-氨基萘、2-氨基萘、3-氨基联苯和4-氨基联苯的标准储备液1.0 mL至100 mL容量瓶中，用甲醇定容，4种芳香胺的浓度分别为10.0，5.0，2.0和1.0 μg/mL。二级混合标准溶液配制：移取10.0 mL一级混合标准溶液至100 mL容量瓶中，用甲醇定容，4种芳香胺的浓度分别为1.0，0.5，0.2和0.1 μg/mL。

内标储备液配制。准确称取100 mg d7-1-氨基萘和20 mg d9-4-氨基联苯，分别置于不同的100 mL棕色容量瓶中，用甲醇定容，得浓度为1.0和0.2 mg/mL的内标储备液。该内标储备溶液于-18℃下避光保存，有效期为3个月。一级混合内标溶液配制：分别移取d7-1-氨基萘、d9-4-氨基联苯储备液1.0 mL置于100 mL容量瓶中，用甲醇定容，浓度分别为10.0和2.0 μg/mL。二级混合内标溶液配制：移取10.0 mL一级混合内标溶液至50 mL容量瓶中，用甲醇定容，浓度分别为2.0和0.4 μg/mL。

标准工作溶液配制。分别移取0.1，0.2，0.5，1.0，2.0，5.0和10 mL二级混合标准溶液置于不同的100 mL容量瓶中，再分别准确加入1.0 mL二级混合内标溶液，用5%氨水甲醇溶液定容，即得表3所示的7级标准工作溶液，d7-1-氨基萘和d9-4-氨基联苯浓度分别为20.0和4.0 ng/mL。

分别对标准工作溶液进行LC-MS/MS分析，并以芳香胺与内标物峰面积比（Y）对其浓度比（X）进行线性回归，得到各目标化合物的标准工作曲线，见表4。其中，1-氨基萘、2-氨基萘内标为d7-1-氨基萘；3-氨基联苯、4-氨基联苯内标为d9-4-氨基联苯。

表3 4种芳香胺的系列标准工作溶液 （ng/mL）

表4 4种芳香胺的线性方程、相关系数、检测限及定量限

取最低浓度的标准工作溶液，平行测定10次，计算其标准偏差，以3倍标准偏差为检测限，10倍标准偏差为定量限，结果如表4所示。1-氨基萘、2-氨基萘、3-氨基联苯、4-氨基联苯的检测限分别相当于0.019，0.018，0.012和0.008 ng/支，定量限分别相当于0.065，0.060，0.039和0.027 ng/支。

2.6 回收率与精密度

取烤烟型和混合型卷烟样品各1种，平行测定3次，并在高、中、低3个水平上进行加标回收率测定，结果（表5）表明，方法的加标回收率范围分别在72.1%～104.6%，70.5%～104.5%，83.1%～104.4%和86.6%～116.5%之间。4种芳香胺的日内精密度＜6%，日间精密度＜9%，可知日内及日间精密度较好。为考察样品的稳定性，将前处理后的样品密闭于2 mL色谱样品瓶中，同一天连续进样5次，4种芳香胺变异系数分别为1.34%，2.05%，1.89%和4.06%。分别在前处理当天和第3，5，7 d进样分析，4种芳香胺变异系数分别为3.22%，8.12%，5.45%和9.09%，表明4种芳香胺在一周内稳定性良好。

表5 4种芳香胺的加标回收率、日内及日间精密度

2.7 样品分析及与GC/MS测定结果比较

选择国内外不同焦油量的烤烟及混合型卷烟20种，采用本方法及GB/T 23358—2009中的GC/MS方法分别对卷烟样品主流烟气中的4种芳香胺进行测定，结果如表6所示。采用本方法所测得20种卷烟主流烟气中1-氨基萘、2-氨基萘、3-氨基联苯、4-氨基联苯的含量 范 围 分 别 为 5.18～20.88，2.17～7.78，0.66～1.92，0.39～1.46 ng/支，平均值分别为 11.80，3.87，1.05，0.75 ng/支。与GC/MS测定结果进行比较，以本方法结果对GC/MS结果作线性回归曲线，1-氨基萘、2-氨基萘、3-氨基联苯及4-氨基联苯的线性相关系数R分别为0.91，0.77，0.86和0.87。可见，两种分析方法的结果相关性较好。

表6 采用本方法与GC/MS测定的20种卷烟主流烟气中4种芳香胺的含量 （ng/支）

3 结论

建立了检测卷烟主流烟气中4种主要芳香胺的LC-MS/MS方法。本方法采用Dikma ProElut PXC阳离子交换固相萃取柱净化样品，省去了衍生化操作，整个样品前处理过程不超过1.5 h；通过对液相色谱条件的优化，实现了1-氨基萘、2-氨基萘、3-氨基联苯和4-氨基联苯两组同分异构体的同时检测。采用本方法及GC/MS对国内外20种不同焦油量卷烟样品进行了分析比较，两种方法的测定结果相关性良好。本方法适合于卷烟主流烟气中4种芳香胺的快速、灵敏测定。

［1］Hoffmann D，Hoffmann I，El-Bayoumy K.The less harmful cigarette：A controversial issue.A tribute to Ernst L.Wynder［J］.ChemicalResearch inToxicology，2001，14（7）：767-790.

［2］IARC.IARC Monographs on the evaluation of carcinogenic risks to Humans：A review of human carcinogens［M］.Lyon：International Agency for Research on Cancer ，2010，100：1-8.

［3］Masuda Y，Hoffmann D，Determination of 1-naphthylamine and 2-naphthylamine in cigarette smoke［J］.Analytical Chemistry，1969，41（4）：650-652.

［4］Hoffmann D，Masuda Y，Wynder E L.α-Naphthylamine and β-naphthylamine in cigarette smoke［J］.Nature，1969，221：254-256.

［5］Zeng Z R，Qiu W L，Yang M，et al. Solid-phase microextraction of monocyclic aromatic amines using novel fibers coated with crown ether［J］.Journal of Chromatography A，2001，934（1-2）：51-57.

［6］Sarafraz-Yazdi A，Mofazzeli F，Eshaghi Z.A new high-speed hollow fiber based liquid phase microextraction method using volatile organic solvent for determination of aromatic amines in environmental water samples prior to high-performance liquid chromatography［J］.Talanta，2009，79（2）：472-478.

［7］Sandeep-Kumar M，Devasish B，Abhilasha D，et al.Determination of some banned aromatic amines in waste water using micellar liquid chromatography［J］.Analytical Methods，2011，3（9）：2032-2040.

［8］王晓瑜，陈义.芳香胺的碱坝聚焦-毛细管电泳分析［J］.高等学校化学学报，2010，31（8）：1506-1509.

［9］Stabbert R，Schäfer K H，Biefel C，et al. Analysis of aromatic amines in cigarette smoke［J］.Rapid Communications in Mass Spectrometry，2003，17（18）：2125-2132.

［10］Brede C，Skjevrak I，Herikstad H.Determination of primary aromatic amines in water food stimulant using solid-phase analyticalderivatization followed by gaschromatography coupled with mass spectrometry［J］.Journal of Chromatography A，2003，983（1-2）：35-42.

［11］Smith C J，Dooly G L，Moldoveanu S C.New technique using solid-phase extraction forthe analysis ofaromatic amines in mainstream cigarette smoke［J］.Journal of Chromatography A，2003，991（1）：99-107.

［12］Saha S，Mistri R，Ray B C.Rapid and sensitive method for simultaneous determination ofsix carcinogenic aromatic amines in mainstream cigarette smoke by liquid chromatography/electrospray ionization tandem mass spectrometry［J］.Journal of Chromatography A，2009，1216（15）：3059-3063.

［13］Aznar M，Canellas E，Nerín C.Quantitative determination of 22 primary aromatic amines by cation-exchange solid-phase extraction and liquid chromatography-mass spectrometry［J］.Journal of Chromatography A，2009，1216（27）：5176-5181.

［14］Mortensen S K，Trier X T，Foverskov A，Petersen J H，Specific determination of 20 primary aromatic amines in aqueous food simulants by liquid chromatography-electrospray ionization-tandem mass spectrometry ［J］. Journal of Chromatography A，2005，1091（1-2）：40-50.

［15］MoriwakiH，HarinoaH，HashimotobH，etal.Determination of aromatic amine mutagens，PBTA-1 and PBTA-2，in river water by solid-phase extraction followed by liquid chromatography-tandem mass spectrometry［J］.Journal of Chromatography A，2003，995（1-2）：239-243.