超声波提取海红果中总黄酮工艺研究

徐玉霞

（宝鸡文理学院，灾害监测与机理模拟陕西省重点实验室，陕西宝鸡 721013)

超声波提取海红果中总黄酮工艺研究

徐玉霞

（宝鸡文理学院，灾害监测与机理模拟陕西省重点实验室，陕西宝鸡 721013)

以海红果为原料，在单因素实验基础上采用二次通用旋转回归组合设计研究了超声波提取海红果中总黄酮的最佳工艺参数。结果表明：4个参试因素对海红果中总黄酮的提取率影响大小顺序为：乙醇浓度＞超声波时间＞提取温度＞料液比，其最佳提取工艺条件为乙醇浓度70%，料液比1∶50，提取温度40℃，超声波时间30min，在此条件下，海红果总黄酮提取率高达0.3100%。

海红果，总黄酮，二次通用旋转回归组合设计

海红果为蔷薇科植物海红子（Malus micromalus Makino）的果实，学名西府海棠[1]。海红果又名海红子、子母海棠、小果海棠，在我国主要分布于晋、陕、蒙交界的三角地区，是一种稀有的地方果树资源。海红果民间食用可消食化滞，除腥去腻[2]。海红果果实含有丰富的矿物质、蛋白质、糖、维生素、氨基酸、总黄酮等营养物质。由于其钙含量高，而且所含的有机钙不仅易被人体吸收，同时还可以促进人体对植物钙的吸收，具有健脾胃、增食欲、助消化等功效，因此，海红果素有“钙王”之美誉[3]。其果实中含有的总黄酮是在其它果品中相对含有较少的营养成分，它是一种激发脑潜能的物质，能有效地激发脑活力，对提高青少年智力产生积极作用，并且能有效抑制成人及老年人的脑功能衰退[4]。药理学实验表明，海红果总黄酮具有保护心脑血管的作用[5]。目前海红果总黄酮的提取工艺尚未有文献报道。本文以陕西府谷海红果为原料，采用单因素结合二次通用旋转回归组合设计建立数学模型，对超声波提取海红果总黄酮的工艺进行了研究，为更好地研究开发和利用海红果资源提供一些参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

海红果 产自陕西省府谷县哈镇，将海红果洗净，自然阴干，50℃恒温烘干，粉碎，过60目筛备用；芦丁对照品 中国药品及生物制品鉴定所；乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠 西安化学试剂厂，分析纯。

TU-1810紫外可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司；AUY120电子分析天平 日本岛津；KQ5200B型超声波清洗器 昆山超声仪器有限公司；RE-85C旋转蒸发器 上海青浦沪西仪器厂；SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵 郑州长城科工贸有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 总黄酮含量的测定方法 采用NaNO2-Al（NO3）3-NaOH体系络合化学吸光法[6]，以芦丁为标准品。

1.2.2 标准曲线的绘制 精密称取120℃减压干燥至恒重的芦丁标准品10mg，置于100mL容量瓶中，加入80%乙醇至刻度，摇匀溶解得对照品溶液[7-8]。分别加入芦丁对照品溶液0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、5.0mL，分别补充80%乙醇至5.0mL，再各加5%NaNO2溶液0.5mL，摇匀放置6min，再各加10%Al（NO3）3溶液0.5mL，摇匀放置6min，最后各加4%NaOH溶液4mL，摇匀放置15min。进行全波长扫描，在508nm波长下有最大吸收峰。以吸光度A为横坐标，浓度C为纵坐标，绘制标准曲线（见图1）。线性回归得芦丁质量浓度Y和吸光度X的关系为：Y=13.571X-0.009，R2=0.9992表明在该浓度范围内线性良好。

图1 总黄酮含量标准曲线Fig.1 Standard curve of total flavonoids content

1.2.3 总黄酮的提取流程 海红果→干燥→粉碎→过筛→乙醇浸泡→超声波处理→抽滤→减压蒸馏浓缩→定容→取样测定总黄酮含量

式中：K-海红果总黄酮含量，%；A-与提取液吸光度对应的浓度黄酮浓度，mg/mL；n-稀释倍数；V-提取液体积，mL；W-海红果干粉末质量，g。

1.2.5 单因素提取工艺参数的确定

1.2.5.1 乙醇浓度对海红果中总黄酮提取率影响 将海红果干粉分别浸泡于10%、30%、50%、70%、90%的乙醇溶液2h，料液比1∶30，温度40℃，在超声波下处理30min，同样方法提取三次，将提取液合并，测定总黄酮含量。

1.2.5.2 料液比对海红果中总黄酮提取率影响 将海红果浸泡于50%的乙醇溶液2h，料液比分别为1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70，提取温度40℃，超声波处理30min，同样方法提取三次，将提取液合并，测定总黄酮含量。

1.2.5.3 提取温度对海红果中总黄酮提取率影响 将海红果浸泡于50%的乙醇溶液2h，料液比1∶40，温度分别为20、30、40、50、60、70℃，超声波处理30min，同样方法提取三次，将提取液合并，测定总黄酮含量。

1.2.5.4 超声波处理时间对海红果中总黄酮提取率影响 将海红果浸泡于50%的乙醇溶液2h，料液比1∶40，温度40℃，超声波处理时间分别为10、20、30、40、50、

1.2.4 海红果总黄酮含量的计算 提取液用相应溶剂定容，稀释适当倍数后吸取1mL置于10mL具塞试管中，按上述标准曲线制作方法测定样品反应液在508nm波长下的吸光值，用回归方程计算总黄酮含量。60min，同样方法提取三次，将提取液合并，测定总黄酮含量。

1.2.6 海红果中总黄酮提取工艺参数优化 在单因素实验的基础上，对乙醇浓度、料液比、提取温度、超声波时间四个因素进行4因子二次通用旋转回归（1/2实施）进行工艺优化，确定其最优提取工艺，因素水平见表1。

表1 实验设计因素水平表Table 1 Factors and levels of the experiment

2 结果与分析

2.1 乙醇浓度对海红果总黄酮提取率的影响

乙醇浓度对海红果中总黄酮提取率的影响如图2所示，海红果中总黄酮含量随着乙醇浓度的增大先增大后减小。当乙醇浓度为50%时，海红果中总黄酮含量达到最高。因而浸提液乙醇浓度选择为50%。

图2 乙醇浓度对总黄酮提取率的影响Fig.2 The influence of concentration of alcohol on content of total flavonoids

2.2 料液比对海红果总黄酮提取率的影响

料液比对海红果中总黄酮提取率的影响如图3所示，在料液比为1∶10～1∶40时海红果中总黄酮含量增加较为明显，在1∶40～1∶70时总黄酮的含量却稍有降低。表明当料液比为1∶40时绝大部分的黄酮已被提取出来。因此料液比选择为1∶40。

图3 料液比对总黄酮提取率的影响Fig.3 The influence of raw solid-liquid ratio on content of total flavonoid

2.3 提取温度对海红果总黄酮提取率的影响

提取温度对海红果中总黄酮提取率的影响如图4所示，在20～40℃时，海红果中总黄酮含量随温度的升高而增大，但超过40℃后，总黄酮含量反而下降。这说明温度对于细胞内物质的溶出起着重要作用，温度过低，溶出速率慢，效率低，但温度过高，对于热敏性的黄酮类性质产生影响，同时能量消耗大。因此提取温度选择为40℃。

图4 提取温度对总黄酮提取率的影响Fig.4 The influence of temperature on content of total flavonoids

2.4 超声波时间对海红果总黄酮提取率的影响

超声波处理时间对海红果中总黄酮提取率的影响如图5所示，随着超声时间的增长，海红果中总黄酮含量先增大后减小，超声波处理时间达到30min后，总黄酮的提取率逐渐降低。因此，超声波处理时间选择30min。

图5 超声波时间对总黄酮提取率的影响Fig.5 The influence of ultrasonic time on content of total flavonoids

2.5 海红果总黄酮提取工艺参数的优化结果

单因素实验表明，乙醇浓度、料液比、提取温度以及超声波时间对海红果总黄酮的提取均具有不同程度的影响。由于各因素间的相互作用比较复杂，因此本实验研究以总黄酮含量为指标，采用二次通用旋转回归设计对提取工艺进行了优化，实验结果见表2。

通过DPS V6.5软件数据分析对表2中的总黄酮含量进行处理，方差分析见表3。据表3结果，计算各项回归系数，以这些回归系数建立海红果总黄酮含量与乙醇浓度、料液比、提取温度、超声波时间4因子的数学回归模型：

表2 二次通用旋转回归组合设计实验及结果Table 2 Design and results of quadric regression orthogonal rotational experiment

其中X1、X2、X3、X4分别为乙醇浓度、料液比、提取温度、超声波时间的编码值。由方差分析可知：回归方程的失拟性检验F1=7.136F0.01（14，5）=9.77极显著，说明模型的预测值与实际值吻合非常好，模型成立。对回归系数显著性检验：在α=0.05显著水平剔除回归方程中不显著项后得到优化后的方程为：

2.6 各单因素对提取率的影响

由表3可知，四个因素的一次项、二次项对海红果总黄酮的提取率的影响在0.01水平达到极显著，乙醇浓度和料液比、提取温度和超声波时间、乙醇浓度和提取温度、料液比和超声波时间的交互作用在0.05水平显著。各因素对海红果中总黄酮的提取率影响大小顺序为：乙醇浓度＞超声波时间＞提取温度＞料液比。通过DPS软件优化功能，可得到海红果中总黄酮提取的最优工艺条件：乙醇浓度70%、料液比1∶50、提取温度40℃、超声波时间30min，在此优化条件下，海红果中总黄酮含量理论值为0.3100%。对该优化条件进行实验验证，其海红果中总黄酮含量为0.3058%，二者相对误差仅1.35%。

由回归系数显著性检验结果可知，各参试因子对海红果中总黄酮提取率均有显著影响。采用降维分析方法，对各因子进行单因子效应影响分析。各单因素对提取率的影响如图6所示，由图可见，当其它三因素固定在零水平下，各单因素对海红果中总黄酮提取率影响程度是不同的。乙醇浓度对海红果中总黄酮含量影响最大，其次是超声波处理时间和提取温度，而料液比对提取率影响最小。总黄酮浓度随着各因素的变化均呈现先升高后降低的趋势。

表3 实验结果方差分析表Table 3 Variance analysis of experimental results

图6 各因素对总黄酮提取率的影响Fig.6 Effect of every factor on content of total flavonoids

2.7 双因素交互作用分析

运用surfer 8作图软件，依据各因素X1、X2、X3、X4对其响应值（Y）所构成的三维空间的曲面图，可反映各因素对其响应值的影响。本实验所建立的模型中X1X2（乙醇浓度与料液比）、X3X4（提取温度与超声波时间）、X1X3（乙醇浓度与提取温度）、X2X4（料液比与超声波时间）的交互项达显著水平，固定两个因素在0水平上，研究另两个因素间的交互作用，根据所作的三维空间曲面图，分析乙醇浓度与料液比、超声时间与提取温度、乙醇浓度与提取温度、料液比与超声波时间的交互作用对提取效果的影响。见图7～图10。

由图7可知，在实验范围内海红果总黄酮提取率随着乙醇浓度的增大是先增后减，要想获得较好海红果总黄酮提取率，最优的乙醇浓度范围应在0.5～1.5水平（实际值乙醇浓度在60%～90%）之间；海红果总黄酮含量随着料液比的增加而增加，最优的料液比范围应在0.5～1.5水平（实际值1∶45～1∶55）之间。在乙醇浓度的不同水平下，随着料液比的增加，海红果总黄酮含量的变化不同；在料液比不同水平下，随着乙醇浓度的增加，海红果总黄酮提取率的变化也有所不同，且乙醇浓度对海红果总黄酮提取率的影响较料液比更加明显。

图7 乙醇浓度（X1）与液料比（X2）交互作用响应面图Fig.7 Response surface plots of flavonoids yield as a function of ethanol concentration（X1）and solid-liquid ratio（X2）obtained from reduced codified model

由图8看出，海红果总黄酮提取率随着提取温度与超声波时间增加呈先增后减的趋势。要想得到较高的海红果总黄酮提取率，最优的提取温度范围应在0～1水平（实际值40～50℃）之间；最优超声波时间范围应在0.5～1水平（实际值35～40min）之间。

图8 提取温度（X3）与超声波时间（X4）交互作用响应面图Fig.8 Response surface plots of flavonoids yield as a function of extraction temperature（X3）and ultrasonic treating time（X4）obtained from reduced codified model

由图9看出，海红果总黄酮提取率随着乙醇浓度与提取温度增加呈先增后减的趋势。要想得到较高的海红果总黄酮提取率，最优乙醇浓度应在0～1水平（实际值50%～70%）之间；最优提取温度范围应在0～0.5水平（实际值40～45℃）之间。

图9 乙醇浓度（X1）与提取温度（X3）交互作用响应面Fig.9 Response surface plots of flavonoids yield as a function of ethanol concentration（X1）and extraction temperature（X3）obtained from reduced codified model

由图10看出，海红果总黄酮提取率亦是随着料液比与超声波时间增加呈现先增后减的趋势。要想得到较高的海红果总黄酮提取率，最优的料液比范围应在0～1水平（实际值1∶40～1∶50）之间；最优超声波时间范围应在0～1水平（实际值30～40min）之间。

图10 料液比（X2）与超声波时间（X4）交互作用响应面图Fig.10 Response surface plots of flavonoids yield as a function of solid-liquid ratio（X2）and ultrasonic treating time（X4）obtained from reduced codified model

3 结论

运用超声波对海红果中总黄酮进行了提取工艺研究，采用二次通用旋转回归组合设计方法研究了乙醇浓度、料液比、提取时间、超声波时间四个因素对海红果总黄酮提取率的影响，并建立了海红果总黄酮提取条件的优化数学模型：Y=0.30070+0.00565X1+ 0.00483X2+0.00497X3+0.00546X4-0.00544X12-0.00422X22-0.00752X32-0.00432X42+0.00336X1X2-0.00286X1X3-0.00286X2X4+0.00336X3X4。所得回归方程与实际情况拟合良好。各因素对海红果总黄酮提取率的影响大小顺序为：乙醇浓度＞超声波时间＞提取温度＞料液比。海红果总黄酮提取的最佳工艺参数为：乙醇浓度70%，料液比1∶50，提取温度40℃，超声波时间30min。在此优化工艺条件下，提取的海红果总黄酮含量可达0.3100%。

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Study on ultrasonic extraction technology of total flavonoids in the fruit of Malus micromalus makino

XU Yu-xia
（Key Laboratory of Disaster Monitoring and Mechanism Simulating of Shaanxi Province，Baoji University of Arts and Sciences，Baoji 721013，China）

Extraction technology of Malus micromalus makino total flavonoids by ultrasonic wave was studied on the basis of single factor experiment and the quadratic general rotation combination design with Malus micromalus makino as raw material.The results showed that the order of the main factors influencing on the extracting effect was as follows：ethanol concentration＞ultrasonic treating time＞extraction temperature＞solid-liquid ratio.The optimum extraction conditions were that the concentration of ethanol 70%，the ratio of solid to liquid 1∶50，extraction at 70℃，ultrasonic time 30min.Under the above mentioned conditions，the total flavonoids yield of Malus micromalus makino was 0.3100%.

fruit of Malus micromalus makino；total flavonoids；quadratic general rotation combination design

TS255.1

B

1002-0306（2012）09-0241-05

2011－08－16

徐玉霞（1978-），女，硕士，讲师，研究方向：资源开发与利用与生态评价。

宝鸡文理学院重点项目（ZK11021）；陕西省重点学科自然地理学资助。