副溶血性弧菌免疫磁珠的制备及其应用

苏晨曦，孙晓红，*，卢 瑛，赵 勇，Vivian C H Wu，潘迎捷

(1.上海海洋大学食品学院，上海水产品加工及贮藏工程技术研究中心，上海 201306;2.美国缅因大学食品科学与人类营养系，美国缅因 04469)

副溶血性弧菌免疫磁珠的制备及其应用

苏晨曦1，孙晓红1，*，卢 瑛1，赵 勇1，Vivian C H Wu2，潘迎捷1

(1.上海海洋大学食品学院，上海水产品加工及贮藏工程技术研究中心，上海 201306;2.美国缅因大学食品科学与人类营养系，美国缅因 04469)

研究比较了不同的免疫磁珠(Immunomagnetic Beads，IMBs)富集捕获副溶血性弧菌的能力。采用两种副溶血性弧菌多克隆抗体，分别包被经羧基和甲苯磺酰胺基基团修饰的磁珠，制备完成5个免疫磁珠(IMB－C1、IMB－C2、IMB－T1、IMB－T2和IMB－T3)。研究引入表面抗体浓度作为评价免疫磁珠捕获能力的特征性参数，两种副溶血性弧菌多克隆抗血清包被的羧基磁珠表现出了较高的表面抗体结合能力，分别为34.25fg/μm2和36.73fg/μm2，明显高于甲苯磺酰胺基磁珠。五个免疫磁珠对副溶血性弧菌捕获能力的研究结果表明:在起始菌液浓度为4.32logCFU/mL时(p＜0.05)，两个羧基磁珠捕获率达到79%和94%，均优于甲苯磺酰胺基磁珠。采用环介导恒温扩增(loop－mediated isothermal amplification，LAMP)技术对免疫磁珠菌体细胞复合物进行体外扩增，结果表明:磁珠的存在并未影响对菌体细胞的后续分子检测。本研究分析比较了不同免疫磁珠的捕获能力，得到羧基磁珠对副溶血性弧菌的捕获能力比甲苯磺酰胺基磁珠强，直接法和间接法偶联方式对免疫磁珠的富集捕获能力无影响。

副溶血性弧菌，免疫磁珠，环介导基因恒温扩增技术，羧基，甲苯磺酰胺基

副溶血性弧菌是常见的食源性致病菌之一，该菌广泛存在于海产品中，人一旦食用，容易引起腹泻、肠痉挛、恶心、呕吐、发热等典型胃肠道反应［1］。目前由副溶血性弧菌引起的食物中毒事件在数量上已经超越沙门氏菌跃居首位，特别是一些沿海城市，由该菌引起的食物中毒占细菌性食物中毒的比例高达60%以上［2－4］。因此，对副溶血性弧菌的检测是食品安全检测的重要内容，如在进出口水产品检测的项目中，在饮用水、食品检测和食品中毒源、传染病源调查等工作中，都需要对该菌进行检测［5］。传统的微生物培养鉴定方法是实验室经典常规的检测鉴定方法，但因其操作繁琐，耗时长等缺点不能满足对食品中副溶血性弧菌进行快速准确检测的要求。近年来随着分子生物学的发展，PCR，DNA探针等技术已广泛应用于副溶血性弧菌的检测中，缩短检测时间，并大大提高检测灵敏度。但是分子生物学检测技术都需要经过样品的前处理－增菌阶段，这不仅耗费大量的检测时间，而且样品组织残渣或抑制性因子也会影响分子技术的检测效率［6］。免疫磁珠分离技术(Immunomagnetic Separation，IMS)通过由载体微球和免疫配基共价偶联而成的免疫磁珠特异性吸附靶目标，直接从样品中或前增菌培养物中分离目的细菌［7］。目前，IMS技术已经广泛应用于微生物富集捕获的研究中，该方法能有效的对样品中的目标菌进行捕获，起到富集浓缩的作用，从而大大缩短前增菌时间，缩小初筛目的菌的范围，提高检测的灵敏度和特异性［8－10］。目前，应用免疫磁珠对副溶血性弧菌进行富集捕获的研究多见于应用领域，如:Hara－Kudo等利用IMS和显色培养基分离贝类中产TDH的副溶血性弧菌 O3:K6［11］。Datta 等［12］利用副溶血性弧菌ATCC17802制备针对极鞭毛的单克隆抗体，快速检测从环境来源的副溶血性弧菌。张凡非等［13］利用IMS分离环境及食品样品中的副溶血性弧菌。据国际上报道［14－15］，不同的化学连接键对免疫磁珠富集捕获效果有影响，但国内无相关报道。本研究通过分析比较不同化学修饰和不同偶联方式的副溶血性弧菌免疫磁珠的捕获能力，获得副溶血性弧菌捕获效率最高的IMBs，为水产品中副溶血性弧菌的快速检测提供技术保障。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

副溶血性弧菌ATCC33846 中国科学院微生物菌种保藏中心;SD－100羧基磁珠(IMB－C) 上海奥润微纳新材料科技有限公司;Dynabeads® M－280 Tosylactivated(IMB－T) Invitrogen公司;羊抗兔IgG SIGMA公司;副溶血性弧菌多克隆抗体 上海友科生物科技有限公司;硫代硫酸盐柠檬酸盐胆盐蔗糖琼脂培养基(TCBS)和胰蛋白胨大豆肉汤培养基(TSB) 北京陆桥技术有限责任有限公司;新西兰大白兔 西普尔必凯公司;Bst DNA Polymerase NEB公司;硫酸镁、脱氧核苷三磷酸(dNTP)、Tween－20 上海sigma生物科技有限公司;小牛血清白蛋白 Solarbio公司;其他试剂均为分析纯。

隔水式恒温培养箱、DK－8D型电热恒温水槽 上海一恒科学仪器有限公司;HS－3垂直混合器 宁波新芝生物科技股份有限公司;DYY－6C电泳仪 北京市六一仪器厂。

1.2 实验方法

1.2.1 菌种的培养 从斜面上挑取一环接种于液体培养基 TSB中，37℃，180r/min摇床培养12h，再取10μL转接新鲜的TSB培养液，37℃，180r/min摇床培养12h。

1.2.2 多抗的制备 取副溶血性弧菌ATCC33846新鲜菌液，紫外灯下灭活处理后，免疫新西兰大白兔，间接ELISA检测血清，待效价＞1∶4000，终止免疫，10d后取血。采用硫酸铵多步沉淀法纯化兔抗血清，得到抗血清R2。

1.2.3 免疫磁珠的制备 羧基磁珠的偶联采用碳二亚胺/N－羟基琥珀酰亚胺(EDC/NHS)活化羧基，加入经过纯化的抗血清R2在室温下反应3h，制备得到免疫磁珠，标示为IMB－C2。采用上海友科公司采购的抗血清R1作对比研究，制备得到免疫磁珠，标示为IMB－C1。甲苯磺酰基磁珠采用两种包被方式:直接法和间接法。直接法，即将抗血清R1和R2溶液分别包被磁珠，室温下反应18h，制备得到免疫磁珠，分别标示为IMB－T1和IMB－T2;间接法，即先将磁珠与羊抗兔IgG溶液混合，室温下进行包被反应3h后再与抗血清R2室温下连接18h，制备得到的免疫磁珠，标示为IMB－T3，采用Bradford法检测偶联抗体后上清液中抗体浓度，计算得到偶联抗体率［16］。

1.2.4 目的菌的捕获 取磁珠0.02mL，加入封闭液0.5mL洗涤5min，至磁力架，去上清。取浓度分别为3.32、4.32和5.32logCFU/mL的菌液各1mL置于放有免疫磁珠的离心管中，再加入0.5mL TSB，混匀，置于垂直混合仪，37℃培养30min(设置不加磁珠的对照组Con.)。置于磁力架上静置，去除上清液。加PBST(含0.1%Tween－20)1mL，洗涤 10min，置于磁力架上静置，去除上清液。再加0.2mL PBST混匀，其中0.1mL涂布TCBS培养基，37℃培养18h计数;另0.1mL混合液用作后续的DNA提取。

1.2.5 免疫磁珠捕获效率的检测 对1.2.4中涂布的平板进行菌落计数，计算菌落数和捕获率，同时以空白磁珠为阴性对照。每个实验重复3次，结果经过P值检测。捕获率的计算公式如下:

捕获率(%)=富集到的菌落数(CFU/0.1mL)/起始菌落数(CFU/0.1mL)×100

1.2.6 煮沸法进行细菌DNA的粗提 取0.1mL磁珠菌液复合物转移至1.5mL的离心管中，于10000×g离心5min，除去上清液，加50μL NaOH(25mmol/L)，混合，95℃ 加热 5min。加入 4μL Tris－HCl buffer(1mol/L，pH7.5)缓冲液，4℃，20000 ×g离心 5min，取上清液作为LAMP反应的模板DNA。

1.2.7 LAMP检测 检测方法参考文献［17］。

2 结果与分析

2.1 免疫磁珠的制备

如图1所示，采用Bradford法定量检测免疫磁珠表面的抗体偶联量，根据标准溶液BSA的蛋白量和吸光度关系，绘制标准曲线:y=0.0195x+0.0153(R2=0.9837;x为蛋白量;y为吸光度值)，将磁珠偶联抗体后上清液的吸光度值代入公式，得到偶联后上清液中蛋白含量，利用公式:

偶联率(%)=(原抗体用量(μg)－偶联上清液的抗体量(μg))/原抗体用量(μg)×100

计算可得羧基免疫磁珠(IMB－C1和IMB－C2)和甲苯磺酰胺基免疫磁珠(IMB－T1、IMB－T2和IMB－T3)的抗体偶联量(如表1所示)。

表1 免疫磁珠的特征参数Table 1 The information of IMBs

图1 BSA标准曲线Fig.1 The standard curve of BSA

由表1可知，不同化学偶联键的免疫磁珠偶联抗体率差异显著;其中，IMB－C2和IMB－T2均具有100%的抗体结合率，且采用间接法制备的IMB－T3抗体结合率也相对较高。将磁珠近似看作球型来计算其单位表面积偶联抗体量，可以得到单位表面积的抗体浓度。羧基磁珠具有较高的表面抗体浓度，分别为 34.25fg/μm2和 36.73fg/μm2，而甲苯磺酰胺基磁珠均比羧基磁珠的表面抗体浓度低了一个数量级。这表明，与甲苯磺酰胺磁珠相比较，羧基连接的免疫磁珠与副溶血性弧菌菌体细胞接触机会更多。

2.2 免疫磁珠捕获效率的检测

不同稀释度的菌液与免疫磁珠反应后，将磁珠和菌体细胞复合物涂布TCBS平板，进行菌落计数，检测捕获量，并计算捕获率，空白磁珠为阴性对照。经过p值检测(p＜0.05)，起始菌量为4.32logCFU/mL时，各个磁珠的捕获能力差异显著，可以用来评价磁珠类型对捕获率的影响。表2中数据表明，针对副溶血性弧菌的检测，羧基磁珠的捕获能力强，分别为79%和94%，明显优于甲苯磺酰胺基磁珠。同时，比较三个甲苯磺酰胺基磁珠，采用二抗包被的甲苯磺酰胺基磁珠IMB－T3与未包被二抗的IMB－T1和IMB－T2相比并没有明显的提高，表明采用直接法或者间接法制备免疫磁珠不会对捕获能力造成影响。纵向比较发现:IMB－C2的捕获率高于 IMB－C1，同时IMB－T2和IMB－T3的捕获率高于IMB－T1。结果表明，无论是羧基偶联还是甲苯磺酰胺基偶联，自制多抗与磁珠的结合能力明显优于后者。

2.3 LAMP检测

在起始菌液浓度分别为4.32 logCFU/mL和3.32 logCFU/mL时，免疫磁珠和菌体细胞复合物的LAMP反应电泳结果如图2所示，从第1泳道到第10泳道均出现亮暗程度不同的梯状条带，LAMP反应检测到副溶血性弧菌的存在(阳性对照为副溶血性弧菌标准菌株ATCC33846，阴性对照为金黄色葡萄球菌)。这表明采用免疫磁珠和副溶血性弧菌菌体细胞复合物进行后续的LAMP检测，核酸扩增过程未受到抑制性影响。

表2 不同免疫磁珠对副溶血性弧菌ATCC33846的捕获率检测Table 2 Enumeration of V.parahaemolyticus by different IMBs

3 讨论

影响免疫磁珠富集捕获目的菌的能力有多方面因素:抗体本身性能的优劣，抗体活性的强弱;磁珠的分散性和吸附性，这与磁珠的制备材料和方法相关;磁珠包被的化学基团，磁珠粒径的大小，这与磁珠和抗体连接的能力相关［18］。

图2 羧基和甲苯磺酰基偶联免疫磁珠和副溶血性弧菌复合物的LAMP反应电泳结果Fig.2 The LAMP results of IMBs and Vibrio parahamolyticus cells complex

本研究中，抗体采用两种方式制备完成，在自制多抗的效价略高于公司购置的多抗的情况下，无论是羧基偶联还是甲苯磺酰胺基偶联，自制多抗与磁珠的结合能力明显优于后者;羧基磁珠的制备材料磁核为四氧化三铁，壳层为氧化硅，实验中分散性较差，吸附性好，甲苯磺酰胺基磁珠的制备材料为三氧化二铁和四氧化三铁，分散性好，吸附性较差;副溶血性弧菌的细胞长度在0.3×2μm，本文所用免疫磁珠的粒径为1.2μm和2.8μm，磁珠的大小能够确保菌体细胞与其能发生碰撞的几率，从而降低了对捕获率的影响。而磁珠包被的化学基团直接关系到了与抗体的结合能力，成为影响免疫磁珠捕获能力的最主要因素。综合考虑磁珠粒径和浓度的不同，调整磁珠的终浓度，使单位表面积在同一数量级上，采用单位表面抗体浓度作为评价指标来衡量免疫磁珠与菌体细胞结合能力的优劣，经过实验证明，切实可行。经过p值检测(p＜0.05)，在起始菌液浓度为4.32logCFU/mL时，免疫磁珠捕获率差异显著，羧基磁珠具有明显的优势，IMB－C2最高为94%，其次为IMB－C1，而这两者的磁珠单位表面抗体浓度分别为36.73fg/μm2和 34.25fg/μm2，均明显高于甲苯磺酰胺基磁珠。将二抗包被于甲苯磺酰胺基磁珠上，是基于甲苯磺酰胺基可以结合任意蛋白，没有选择性，先包被二抗可以保证其与多抗连接时的特异性，但是从捕获率的检测结果来看，不论是直接法还是间接法偶联抗体，对捕获效率的影响并不大。

国际上，Shu－I曾采用TRF技术分析比较了羧基磁珠、甲苯磺酰胺基磁珠和链酶亲和素磁珠捕获E.coli O157∶H7的能力，链酶亲和素磁珠的捕获能力最强，其次为羧基磁珠，最后为甲苯磺酰胺基磁珠，与本文的结果基本吻合。且本研究中采用显色培养基可以获得捕获到的目的菌活菌数，以便被作为IMS和诸多检测技术结合使用的参考。本研究采用LAMP方法对IMBs的富集效果进行了检测，以考察免疫磁珠菌体复合物是否会对后续相关的核酸检测产生抑制性因子的作用。结果表明免疫磁珠和副溶血性弧菌菌体细胞复合物对LAMP反应并没有抑制作用，且由于免疫磁珠的加入，同时减少了DNA提取过程中的损失率，更利于LAMP的检测。

综上所述，本研究比较分析了不同的免疫磁珠捕获副溶血性弧菌菌体细胞的能力，得到羧基磁珠优于甲苯磺酰胺基磁珠，直接法和间接法偶联方式对免疫磁珠的富集捕获能力无影响;采用LAMP方法对免疫磁珠和副溶血性弧菌菌体细胞复合物进行检测，收到了很好的检测效果，希望能为副溶血性弧菌快速检测方法的建立提供新思路。

［1］苏世彦.食品微生物检验手册［M］.北京:中国轻工业出版社，1998:161－165.

［2］李晓春.浙南部沿海地区细菌性食物中毒病源检测研究分析［J］.中国预防医学杂志，2004，5(5):370－373.

［3］刘弘，王科家.上海市集体性食物中毒分析［J］.上海预防医学杂志，2003，15(11):454－456.

［4］江伟珣，刘毅.营养与食品卫生学［M］.北京:北京医科大学和中国协和医科大学联合出版社，1992:244－246.

［5］孟庆显.海水养殖动物病害学［M］.北京:中国农业出版社，1996:63－76.

［6］钟凯，田静.食品中副溶血性弧菌PCR快速检测方法的研究［J］.中国食品卫生杂志，2004，16(4):317－319.

［7］王晓闻，杨永莉.免疫磁珠捕获－PCR检测牛乳中沙门氏菌的研究［J］.山西农业大学学报，2009，29(4):289－293.

［8］徐晓可，吴清平，张菊梅，等.免疫磁珠分离技术在常见食源性致病菌检测中的应用［J］.中国卫生检验杂志，2009，19(5):1196－1198.

［9］赵文彬，周克捷，李家富，等.应用免疫磁珠法分离大肠杆菌 O157∶H7［J］.现代预防医学，2000，27(3):331－332.

［10］寇运同，雷质文，林修光，等.用免疫磁珠捕集法快速检测食品中的单核增生李斯特菌［J］.检验检疫科学，2001，11(6):12－13.

［11］Hara－Kudo Y，Sμgiyama K，Nishina T，et al.Detection of TDH－producing Vibrio parahaemolyticus O3:K6 fr om naturally contaminated shellfish using an immunomagnetic separati on method and chromogenic agarmediμm［J］.Kansenshogaku Zasshi，2001，75(11):955－960.

［12］Datta S，Janes M E，Simonson J G.Immunomagnetic separation and coagglutinati on of Vibrio parahaemolyticus with anti－ flagellar protein monoclonal antibody［J］.Clin Vaccine I mmunol，2008，15(10):1541－1546.

［13］张凡非，杉山宽治，西尾智裕，等.利用免疫磁珠法分离环境及食品中产生TDH副溶血性弧菌的研究［J］.中国卫生监督杂志，2004，11(1):7－9.

［14］Tu S－ I，Uknalis J，Gore M，et al.Factors affecting the bacterial capture efficiency of immuno beads:a comparison between beads with different size and density［J］.Rapid Meth Autom Microbiol，2003，11:35－46.

［15］刘辉荣，徐宏，古宏晨，等.简便高效分离细胞新型免疫磁珠制备［J］.中国公共卫生，2008，24(11):1349－1351.

［16］杨桂兰，郭学平.Lowry法和Bradford法测定玻璃酸钠中蛋白质含量的比较［J］.中国生化药物杂志，2003，24(3):131－133.

［17］徐芊，孙晓红，赵勇，等.副溶血弧菌LAMP检测方法的建立［J］.中国生物工程杂志，2007，27(12):66－72.

［18］Shu－ I Tu，Sue Reed，et al.Capture of Escherichia coli O157∶H7 using immunomagnetic beads of different size and antibody conjugating chemistry［J］.Sensors，2009(9):717－730.

Preparation and application of Vibrio parahaemolyticus using immunomagnetic beads

SU Chen－xi1，SUN Xiao－hong1，*，LU Ying1，ZHAO Yong1，Vivian C H Wu2，PAN Ying－jie1
(1.College of Food Science and Technology，Shanghai Engineering Research Center of Aquatic－Product Processing ＆ Preservation，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306，China;2.Department of Food Science and Human Nutrition，University of Maine，Maine 04469，USA)

The objective of this study was to use Immunomagnetic beads(IMBs)to detect Vibrio parahamolyticus.IMBs were synthesized using anti－ V.parahaemolyticus polyclonal antibody(commercial antibody R1 and selfregulating antibody R2)and magnetic beads coated with activated carboxyl groups and tosylated surfaces groups(two carboxyl IMBs IMB－C1 and IMB－C2;three toslated IMBs IMB－T1，IMB－T2 and IMB－T3 which coated by the secondary antibody and polyclonal antibody).After the IMS process，one part of suspension was plated on TCBS to count the colony，the other to extract DNA with thermal cracking for Loop－mediated Isothermal Amplification(LAMP).The antibody concentration per surface area(AC/SA)was used for evaluation the properties of IMBs.The result showed that the AC/SA of the carboxyl IMBs are higher than toslated IMBs(34.25fg/μm2and 36.73fg/μm2).And the carboxyl IMBs captured more V.parahaemolyticus during the IMS process than toslated IMBs，when the pure culture concentration was about 4.32logCFU/mL(p ＜0.05).After the IMS process，approximately 79%and 94%of the cells in suspension were captured by the carboxyl beads with commercial and self－regulating antibodies.And，there were not obviously different about the capturing rate between the directed and indirected conjugation methods，compared the IMB－T3 and IMB－T2.The LAMP results showed that the molecule detection method was not influenced by the IMBs－cell complex.

Vibrio parahaemolyticus;immunomagnetic beads;loop－mediated isothermal amplification;carboxyl groups;tosylated groups

TS207.4

A

1002－0306(2012)17－0313－04

2012－02－29 *通讯联系人

苏晨曦(1985－)，女，在读硕士，研究方向:食品安全。

霍英东教育基金会第十一届高等院校优选资助课题(114035);上海市科技兴农重点攻关项目(沪农科攻字2009年第6－1号);上海市教育委员会重点学科建设项目资助(J50704)。