钛胶柱反相高效液相色谱法测定饮料中的阿斯巴甜

包 荣，李 荣，谭 津，姜子涛*

(天津商业大学生物技术与食品科学学院，天津市食品生物技术重点实验室，天津 300134)

钛胶柱反相高效液相色谱法测定饮料中的阿斯巴甜

包 荣，李 荣，谭 津，姜子涛*

(天津商业大学生物技术与食品科学学院，天津市食品生物技术重点实验室，天津 300134)

建立基于钛胶柱对无糖可乐中甜味剂阿斯巴甜的高效液相色谱快速测定方法。色谱条件：分离柱为Titania Sachtopore-RP柱(250mm×4.6m，5μm)，柱温70℃，流动相为V[15mmol/L磷酸铵缓冲溶液，(NH4)2HPO4:NH4H2PO4＝6:4；10mmol/L氟化铵]-V(甲醇)＝70:30，流速1mL/min，检测波长217nm。线性范围为10～2500μg/mL，最低检出限为0.08μg/mL，回收率为92.5%～97.4%，相对标准偏差(n＝8)小于0.72%。本法准确度和精密度均可满足饮料中阿斯巴甜的测定要求。

阿斯巴甜；钛胶柱；高效液相色谱法；无糖可乐

阿斯巴甜(aspartame)又名甜味素、天冬甜母、天冬甜精，学名称为天门冬酰苯丙氨酸甲酯(分子式为C14H18N2O5，相对分子质量为294.31)，化学结构见图1。

图1 阿斯巴甜的化学结构Fig.1 Chemical structure of aspartame

阿斯巴甜的甜味特征几乎与蔗糖相同，较纯正，甜度是蔗糖的200倍[1]。阿斯巴甜在干燥状态下较稳定，在溶液中的稳定性受pH值、温度和放置时间的影响较大[2]。溶液pH值在3～6时，其稳定性良好，pH＜3时易水解成天冬氨酰苯丙氨酸，当pH＞6时易环化生成苯甲基-3,6-双氧-2-哌嗪乙酸。在室温下，当pH值为4.3时最为稳定，半衰期约为300d。在pH7的环境下，其半衰期则仅有数天。然而大部分饮料的pH值都介于2.36～3.98间[3]，所以添加在饮料中的阿斯巴甜均很稳定。1967年美国将其作为甜味剂使用。目前已有包括中国和美国在内的80多个国家允许将阿斯巴甜应用于除罐头食品外的所有食品，其用量按生产需要适量使用[4]。因阿斯巴甜甜味高和热量低，主要添加于饮料、维他命含片或口香糖代替糖的使用。许多糖尿病患者、减肥人士都以阿斯巴甜作为糖的代用品。但阿斯巴甜受温容易分解而失去甜味，不适用于热加工食品。另外，由于苯酮尿症患者无法代谢苯丙氨酸等含苯环类的氨基酸，因此需避免接触阿斯巴甜。

目前，全球阿斯巴甜的年消费增长率已超过20%，远远超过其他人工合成甜味剂平均增长率5%的速度。但目前国际上对阿斯巴甜的安全性存在很大争议，多国研究人员动物实验证明了阿斯巴甜对人体有害，并呼吁阿斯巴甜下架。但也有人认为，阿斯巴甜能致人患肿瘤这一说法缺乏科学依据[5]。无论如何，阿斯巴甜作为一种食品添加剂，其应用范围正逐渐扩大，为避免其对人体的潜在危害，添加量应受到严格监控，为此有必要完善在食品中快速检测阿斯巴甜含量的方法。关于阿斯巴甜含量的测定方法已有气相色谱法[6]、高效液相色谱法[5,7-12]和毛细管电泳法[12-15]方面的报道。但由于硅胶ODS柱本身固有的“第二效应”的存在，常常导致阿斯巴甜色谱峰对称性差，影响分离效率，色谱柱寿命降低。

钛胶基质固定相是近年发展起来的新型色谱填料，其具有传统的硅胶基质固定相不可比拟的优点，不存在硅胶固定相对碱性化合物存在“不可逆吸附”的致命缺陷。并且钛胶具有极好的化学稳定性，在pH1～14的范围内都是非常稳定的，而硅胶固定相则仅仅适用于pH3～9的范围内。在现在的研究中，将应用钛胶基质C18作为固定相，建立钛胶柱反相高效液相色谱法测定饮料中阿斯巴甜的新方法，并应用于无糖可乐样品中阿斯巴甜的含量测定。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

无糖可乐 市购；阿斯巴甜标准品(aladdin，99.0%)，配制成2.5mg/mL标准贮备液：称取0.125g阿斯巴甜置于50mL容量瓶中，用纯净水(H3PO4调至pH4.3)溶解并定容至刻度，置于冰箱备用。甲醇(色谱纯)、磷酸氢二铵(色谱纯) 天津市科密欧化学试剂有限公司；氟化铵(色谱纯)、磷酸二氢铵(色谱纯) 天津市光复精细化工研究所；纯净水 杭州娃哈哈集团有限公司。

1200系列高效液相色谱仪 美国安捷伦公司；钛胶基质C18反相色谱柱(Sachtopore-RP，5μm diameter，300A°pore size，250mm × 4.6mm i.d.) 美国 Zirchrom 公司；FA1104N电子天平 上海精密科学仪器有限公司。

1.2 色谱条件

流动相为V[15mmol/L磷酸铵缓冲溶液，(NH4)2HPO4:NH4H2PO4＝6:4；10mmol/L氟化铵]-V(甲醇)＝70:30，等梯度洗脱流速1.0mL/min，柱温70℃，紫外波长扫描范围200～400nm。以保留时间和紫外吸收谱图定性，峰面积定量。

1.3 标准曲线的绘制

取2.5mg/mL阿斯巴甜标准贮备液，分别稀释为10、50、100、200、500、800、1000μg/mL，依次取20μL进样，以阿斯巴甜质量浓度/(μg/mL)为横坐标、峰面积为纵坐标绘制标准曲线并计算线性回归方程。

1.4 样品测定

取适量不同品牌的市售无糖可乐样品，超声脱气后，准确量取1mL的样品放入10mL比色管中，稀释至刻度，经0.45μm微孔滤膜过滤后进样20μL。根据阿斯巴甜色谱峰面积，通过标准曲线计算得到样液中的阿斯巴甜质量浓度。

2 结果与分析

2.1 检测波长的选择

用紫外分光光度计对稀释后可乐样品在200～400nm范围内进行波长扫描，由扫描结果可知：阿斯巴甜的最大吸收波长出现在217nm，故后面的测定中选择色谱UV检测器的波长为217nm。阿斯巴甜标准品的色谱图见图2。

图2 阿斯巴甜标准品的色谱图Fig.2 Chromatogram of aspartame standard

2.2 柱温选择

经考察，柱温对半峰宽及保留时间影响显著。保持流动相其他条件不变，改变柱温，分别为25、40、50、60、70℃。结果显示，随柱温增大柱效不断提高，见图3。为达到阿斯巴甜的最佳分离，实验选择柱温70℃。之所以没有继续提高温度，因有资料显示阿斯巴甜在80℃左右会有部分分解，同时色谱流动相的产气现象会较明显。

图3 塔板数与柱温的关系Fig.3 Effect of column temperature on the number of plates

2.3 流动相中磷酸盐浓度的选择

分别选取流动相中磷酸盐的浓度为5、10、15mmol/L和17mmol/L进行分析。结果如图4所示，随磷酸盐浓度增大，峰宽及保留时间均减小，因此，选择磷酸盐浓度最佳条件15mmol/L。磷酸盐浓度过小，阿斯巴甜峰展宽现象比较严重；磷酸盐浓度过大时，阿斯巴甜保留时间短，溶剂峰及其他保留值较小的物质易产生干扰。

图4 半峰宽(A)、保留时间(B)与磷酸盐浓度的关系Fig.4 Effect of ammonium phosphate buffer concentration on the peak width at half height (A) and retention time (B)

2.4 流动相pH值的选择

改变流动相中缓冲液的pH值，即(NH4)2HPO4和NH4H2PO4的比例分别为3:7、1:1、6:4、7:3和8:2，之后用于阿斯巴甜的色谱分析。结果表明，(NH4)2HPO4:(NH4)H2PO4越大，即pH值越大，峰宽和保留时间越小，见图5。选择最佳条件(NH4)2HPO4:(NH4)H2PO4＝6:4。若此比例继续增大，峰宽会减小，但保留时间过短不易与杂质分离。

图5 半峰宽(A)、保留时间(B)与磷酸盐比例的关系Fig.5 Effect of ammonium phosphate composition on the peak width at half height (A) and retention time (B)

2.5 流动相中氟化铵浓度的选择

分别选取5、10、12、15mmol/L考察氟化铵浓度对分析效果的影响。结果显示，随氟化铵浓度增大，峰宽及保留时间增大，增大至10mmol/L后，曲线趋于平滑，影响较小，见图6。选择氟化铵浓度最佳条件10mmol/L，浓度较小时，保留时间较短易产生干扰。

图6 半峰宽(A)、保留时间(B)与氟化铵浓度的关系Fig.6 Effect of ammonium fluoride concentration on the peak width at half height (A) and retention time (B)

2.6 流动相中甲醇体积分数的选择

固定以上条件，分别配制甲醇体积分数2 0%、30%、40%和50%的溶液。当甲醇体积分数为20%时，阿斯巴甜峰形较宽；40%和50%时出峰时间太短，不易与杂质分离，见图7。可见在30%时，出峰时间适中，峰形较好，且可与样品中杂质分离，故选用甲醇体积分数为30%。

图7 半峰宽(A)、保留时间(B)与甲醇体积分数的关系Fig.7 Effect of methanol concentration on the peak width at half height (A) and retention time (B)

2.7 检出限及线性范围

以达到信噪比3倍的信号值为最低检出限，计算得0.08μg/mL。同时考察此方法的线性范围，选取10、50、100、200、500、800、1000μg/mL和2500μg/mL 八个质量浓度。结果显示：当阿斯巴甜在10～2500μg/mL范围内，标准曲线线性良好，线性回归方程为Y＝177.7034＋15.6243X(R2＝ 0.9994)。

2.8 方法精密度和准确度

图8 3种无糖可乐样品的色谱图Fig.8 Chromatogram of three diet coke samples

在选定的色谱条件下，分别用200μg/mL和500μg/mL标准溶液重复进样8次，计算得准确度相对标准偏差小于0.72%。在3个可乐样品中加入一定量的阿斯巴甜标准品，与样品一致处理后进样测定，样品测定结果及方法回收率见表1，样品色谱图见图8。由表1可见，本法回收率范围为92.5%～97.4%，平均回收率为95.4%(标准溶液及样品均平行测定3次取平均值)。

表1 样品测定结果和加标回收率Table 1 Determination results of samples and spiked recoveries

3 结 论

钛胶基质色谱固定相为近年来出现的新型色谱填料，其研究和应用有待于进一步深入，本研究结果显示：在最低检出限、精密度、线性范围方面钛胶柱已略见优势，有较好的应用前景。现阶段钛胶柱仍存在比表面积较小，柱效较低的缺陷，因此峰形略宽。在此之前虽有流动相中不添加缓冲液的报道，但在钛胶高效液相色谱测定的实际应用中，往往存在色谱峰形较差拖尾等现象。本法简单易操作、选择性强、常见成分无干扰、精密度、重现性和回收率较高，适用于无糖可乐及其他食品样品中阿斯巴甜的定量分析。从经济角度讲，流动相采用甲醇-水体系，与乙腈相比节约成本，适于推广应用。

[1] 姜彬, 冯志彪. 甜味剂研究进展[J]. 山西食品工业, 2005(3): 16-19.

[2] GIBBS B F, ALLI I, MULLIGAN C N. Simple and rapid high-performance liquid chromatographic method for the determination of aspartame and its metabolites in foods[J]. J Chromatogr A, 1996, 725(2):372-377.

[3] 刘兴容, 周学东, 张萍. 市售饮料pH值、缓冲能力、钙、磷、氟含量的测定及意义[J]. 泸州医学院学报, 2001, 24(2): 112-114.

[4] 史贤明. 食品安全与卫生学[M]. 北京: 中国农业出版社, 2003: 264-265.

[5] 杨柳桦, 王林, 孙成均. 高效液相色谱法测定保健食品和饮料中的阿斯巴甜[J]. 分析试验室, 2007, 26(7): 79-82.

[6] 封雷, 蒲朝文, 汪瑜等. 气相色谱法测定保健营养甜味剂中的甜蜜素[J]. 中国卫生检验杂志, 2002, 12(3): 312-313.

[7] 贾玉珠, 骆和东, 林建. HPLC法同时测定饮料中5种添加剂的研究[J]. 中国卫生检验杂志, 2005, 15(4): 448-449.

[8] 鲁琳, 杭义萍, 高燕红. 高效液相色谱法快速检测乳饮料中常用甜味剂[J]. 食品科学, 2009, 30(10): 166-168.

[9] 陈金东, 李蔚. 高效液相色谱法同时测定食品中阿斯巴甜、阿力甜[J]. 中国卫生检验杂志, 2006, 16(9): 1069-1070.

[10] 倪梅林, 谢东华, 房科腾, 等. 高效液相色谱法测定食品中阿斯巴甜的含量[J]. 光谱实验室, 2009, 26(1): 23-26.

[11] 李皓, 陈长武, 张培刚, 等. HPLC法测定果冻食品中阿斯巴甜含量的研究[J]. 食品科学, 2008, 29(8): 520-522.

[12] 黄百芬, 铁晓威, 任一平. 应用液相色谱法和毛细管电泳法对阿斯巴甜及其相关杂质的测试[J]. 中国食品添加剂, 2002(5): 83-91.

[13] 孙保国, 侯鹏亮, 林雁飞, 等. 胶束电动毛细管电泳同时测定饮料中的多种添加剂[J]. 分析科学学报, 1999, 15(2): 124-125.

[14] BOYCE MC. Simultaneous determination of antioxidants, preservatives and sweeteners permitted as additives in food by mixed micellar electrokinetic chromatography[J]. J Chromatogr A, 1999, 847(1/2): 369-375.

[15] PESEK J J, MATYSKA M T. Determination of aspartame by highperformance capillary electrophoresis[J]. J Chromatogr A, 1997, 781(1/2): 423-428.

Determination of Aspartame in Diet Coke Samples by RP-HPLC on Titania

BAO Rong，LI Rong，TAN Jin，JIANG Zi-tao*
(Tianjin Key Laboratory of Food Biotechnology, College of Biotechnology and Food Science,Tianjin University of Commerce, Tianjin 300134, China)

A method to determine aspartame in diet coke by high performance liquid chromatography on a titania column was described in this paper. The samples were separated on a titania Sachtopore-RP column (250 mm×4.6 mm, 5 μm at 70 ℃ using 15 mmol/L ammonium phosphate buffer ((NH4)2HPO4:NH4H2PO4=6:4) added with 10 mmol/L ammonium fluoride and methanol in the ratio of 70 to 30 as mobile phase. The flow rate was 1 mL/min and the detection wavelength was 217 nm. The linear range of the method was 10－2500 μg/mL with a Detection limit of 0.08 μg/mL. The recoveries of the method were between 92.5%and 97.4%. The relative standard deviation of the method was less than 0.72%. The method is simple, fast, accurate and precise and may be used in the determination of aspartame in drinks.

aspartame；titania；RP-HPLC；sugarless coke

TS207.3

A

1002-6630(2012)10-0150-05

2011-04-26

国家自然科学基金面上项目(20875069)

包荣(1985—)，女，硕士研究生，主要从事食品添加剂研究。E-mail：hedi572006@126.com

*通信作者：姜子涛(1956—)，男，教授，博士，主要从事食品添加剂与食品分析研究。E-mail：ztjiang@tjcu.edu.cn