荧光探针法快速检测果汁中罗丹明B残留量

梁 宇，黄世江，王超海，程定玺,*

(1.河南师范大学化学与环境科学学院，河南 新乡 453007；2.新乡学院化学与化工学院，河南 新乡 453003)

荧光探针法快速检测果汁中罗丹明B残留量

梁 宇1,2，黄世江1，王超海2，程定玺1,*

(1.河南师范大学化学与环境科学学院，河南 新乡 453007；2.新乡学院化学与化工学院，河南 新乡 453003)

建立以伊红Y为荧光探针测定罗丹明B残留量的荧光光谱法。在pH6.8的Sфrensen缓冲溶液中，一定浓度的阳离子表面活性剂溴化十六烷基三甲基铵(CTMAB)能使阴离子染料伊红Y的荧光强度显著增强，当加入一定量的罗丹明B后其荧光发生猝灭，且猝灭程度在一定范围内与加入的罗丹明B浓度呈正比。通过改变单因素，优化实验条件，获得的线性范围为0～0.9mg/L，检出限为0.0016mg/L，回收率为101.3%～113.7%，相对标准偏差为2.76%～4.98%。该方法具有简便快捷、选择性好、灵敏度高等优点，适用于果汁饮料制品中罗丹明B的检测。

荧光探针；伊红Y；罗丹明B；残留

罗丹明B(rhodamine B，RhB)是一种人工合成染料，常用做荧光分析试剂[1]。有研究表明：罗丹明B能引起皮下组织生瘤，具有致癌性[2]。根据国际癌症研究署(IARC)化学品致癌风险评价表明：摄取、吸入以及皮肤接触该物质均会造成急性和慢性的中毒伤害[3]。早在20世纪末，欧美、日本等国家和地区就己明令禁止将罗丹明B用于食品加工中，我国也将其列入《食品中可能违法添加的非食用物质名单(第一批)》进行重点监管。但由于罗丹明B具有价格低廉、着色稳定、色泽鲜艳等特点，将其添加到食品中的违法事件仍时有发生，严重危害人们的饮食安全。

然而目前对食品中罗丹明B的检测仍没有国家标准，现行的行业标准[4]和现有的检验方法主要是色谱法[5-9]和酶联免疫法[10-11]，这些方法分析仪器昂贵，样品前处理繁琐，检测耗时。罗丹明B本身虽具有很强的荧光，但在本实验测量范围内其荧光强度较低，而且在处理样品时有机溶剂对罗丹明B的荧光强度影响很大。本研究探究并建立用荧光探针快速检测罗丹明B的荧光光谱法，快速测定果汁中罗丹明B残留量，可为国家标准的建立和测定提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

果汁饮料 市售。

罗丹明B(分析纯) 天津市化学试剂一厂；伊红Y(EY)(分析纯) 上海化学试剂总厂；溴化十六烷基三甲基铵(CTMAB)(分析纯) 上海试剂一厂；甲醇、乙醇、丙酮和乙睛(均为分析纯) 北京化工厂。

1.2 仪器与设备

HC-2064高速冷冻离心机 上海金鹏分析仪器有限公司；FP-6500型荧光光谱仪 日本Jasco公司；KQ-218超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司；RE-2000旋转蒸发器 上海亚荣生化仪器厂。

1.3 方法

1.3.1 样品处理方法

[12]方法：准确移取1.0mL果汁于50mL具塞离心管中，加入25mL 20%的甲醇溶液后超声振荡30min，然后以8000r/min的速度离心10min。取部分上清液于10rnL容量瓶中，并用水定容，即得到待测样品溶液，备用。

1.3.2 实验方法

在一系列10mL容量瓶中依次加入1.0mL浓度为1.0×10-4mol/L的伊红Y溶液，0.8mL pH值为6.8的Sфrensen缓冲溶液，0.8mL浓度为1.0×10-2mol/L的CTMAB和10mg/L罗丹明B溶液，振荡使其充分反应，静置15min后，用波长为531nm的激发光激发，测定其在547nm波长处的发射光强度I，同时在相同条件下测定空白对照液的荧光强度I0。

2 结果与分析

2.1 荧光光谱

图1 荧光光谱Fig.1 Fluorescence spectra

如图1所示，在pH值为6.8的Sфrensen缓冲溶液中，EY的最大激发和发射波长分别为520nm和538nm(曲线1)，当向其中加入一定量的罗丹明B后，其荧光强度随着罗丹明B浓度的增大而略有降低(曲线2、3)。相同条件下，当向EY中加入一定浓度的CTMAB后，溶液的颜色由粉红色变成桃红色，体系的最大激发和发射波长分别红移至531nm和547nm，且荧光强度明显增强(曲线4)；当再向其中加入一定量的罗丹明B后，体系的荧光强度降低(曲线5、6)，且降低的程度与加入罗丹明B的量在一定范围内呈良好的线性关系，因此该体系可用于罗丹明B残留量的测定。

实验机理可能是：表面活性剂CTMAB浓度达到一定浓度后，形成胶束，对EY有增敏效应，使其荧光强度显著增强。因为EY与罗丹明B之间的作用力大于EY与CTMAB之间的作用力，所以当向EY-CTMAB体系中加入罗丹明B后，罗丹明B替代了CTMAB的位置。又由于罗丹明B对EY的荧光增敏效应小于CTMAB的胶束增敏效应，所以体系的总体荧光强度随罗丹明B浓度的增加而呈下降趋势。

2.2 条件优化实验

2.2.1 反应体系的选择

分别选取阳离子型、阴离子型和非离子型表面活性剂各两种，与EY形成EY-CTMAB、EY-CPB、EYSDBS、EY-SDS、EY-OP和EY-Tween-80等体系进行对比实验。结果表明：以EY-CTMAB体系进行测定时，ΔI值最大(ΔI＝I0－I，I0和I分别为未加入和加入罗丹明B时体系的荧光值)，灵敏度最高且体系最稳定，故本实验选取EY-CTMAB体系。

2.2.2 缓冲溶液及酸度的选择

已知EY在近中性和微碱性环境中发强荧光，因此选取pH值为7.0的Kolthoff、Sφrensen、Michaelis、Britton-Robinson、Clark-Lubs等几种缓冲溶液进行实验，结果表明：在Sфrensen缓冲溶液中得到的ΔI值最大，因此本实验选取Sфrensen缓冲溶液。接着使用pH值为5.0～10.0的系列Sфrensen缓冲溶液进行实验，结果表明：当pH≤7.0时，体系的荧光强度随着pH值的增大逐渐增强，体系的灵敏度也逐渐升高；当pH 7.0～9.0时，体系的荧光强度基本稳定；当pH≥9.0时，体系的荧光强度随着pH值的增大而迅速降低。当pH≥7.0时，体系的灵敏度先略有降低后保持稳定。当pH6.8时，体系的荧光强度和灵敏度均达到最大，且此时获得的线性关系良好。因此本实验选取缓冲溶液的pH值为6.8。

2.2.3 最佳EY浓度的选择

在一定范围内，体系的荧光强度随着EY浓度的增加而逐渐增强，并且体系的灵敏度ΔI值随EY浓度的增大增加到最大后趋于稳定。当EY浓度达到1.0×10-5mol/L时，体系的荧光强度达到最大，灵敏度最大且稳定，并且此时体系具有很好的线性关系，所以本实验选取1.0×10-5mol/L为EY的最佳浓度。

2.2.4 最佳CTMAB浓度的选择

在一定浓度范围内，体系的荧光强度随着CTMAB浓度的增加迅速增大到最大值后保持稳定，灵敏度先迅速升高后又略微降低。当CTMAB的浓度为8.0×10-4mol/L时，体系的灵敏度ΔI有最大值，且此时体系的荧光强度较高，因此本体系选择8.0×10-4mol/L为CTMAB的最佳浓度。

2.2.5 缓冲溶液用量的选择

随着缓冲溶液用量的增加，体系的荧光强度逐渐增加到最大后保持不变，而灵敏度随着缓冲溶液用量的增加却有所降低。当缓冲溶液用量为0.8mL时，体系的灵敏度最高且体系的荧光强度有最大值。本实验最终选定0.8mL为缓冲溶液最合适用量。

2.2.6 试剂加入顺序的选择

按照排列组合原理，本实验考察4种不同试剂共24种不同加入顺序对体系荧光强度的影响。当加入顺序为EY→CTMAB→Sфrensen→罗丹明B和EY→Sфrensen→CTMAB→罗丹明B时，体系的灵敏度ΔI较大，荧光强度较强，本实验选择的加入顺序为：EY→CTMAB→Sфrensen→罗丹明B。

2.2.7 反应温度和时间的影响

随着温度的升高，体系的荧光强度逐渐降低，体系的灵敏度也略有降低，因此实验应在较低温度下进行。体系在反应15min后达到稳定且在2h内荧光强度减幅在5%以内。本实验选取在室温20℃条件下反应15min后进行测定。

2.2.8 离子强度的影响

通过加入0.1mol/L的NaCl溶液来考察离子强度对体系的影响。离子强度对体系的影响很小，随着NaCl加入量的增加，体系的荧光强度略有增强，而灵敏度却稍有降低。因此本实验在测定时选择不加入NaCl溶液，不改变溶液的离子强度。

2.2.9 有机溶剂的影响

通过向体系中添加甲醇、乙醇、丙酮和乙腈等几种常见有机溶剂，来考察处理样品时带入的有机溶剂对测定结果的影响。随着甲醇含量的增加，体系的荧光强度逐渐降低。随着乙醇和乙腈含量的增加，体系的荧光强度均略有增强。当丙酮含量小于7%时，体系的荧光强度基本不变；当丙酮含量大于7%时，随着丙酮含量的增加体系的荧光强度迅速降低。但是随着4种有机溶剂含量的增加，体系的灵敏度均逐渐降低。因此，在处理样品时，应避免使用或尽量少用有机溶剂。本实验在处理样品时引入的甲醇经多次稀释后，其含量不会对测量结果造成明显影响。

2.3 工作曲线

按前述实验方法，得到测定罗丹明B残留量的标准工作曲线，线性方程为：I＝450.6－347.1C/(mg/L)，R＝0.9996，线性范围为0～0.9mg/L。对含量为0.4mg/L的罗丹明B标准溶液11次平行测定的平均值为0.3963mg/L，相对标准偏差(RSD)为3.29%。

2.4 干扰物质的影响

在优化的实验条件下，考察果汁饮料中常见离子和物质对罗丹明B含量测定的影响。当罗丹明B溶液质量浓度为0.2mg/L，相对误差控制在±5%以内，测定时各种物质的最大允许倍数分别是：Na+、K+、Cl－、Br－(2000)，L-精氨酸、L-赖氨酸、L-脯氨酸、L-半光氨酸、L-甘氨酸、葡萄糖(1000)，VC、VE、NH4+(500)，Mg2+、Zn2+(300)，Ca2+(200)，Fe3+、Cu2+(100)。由于样品被稀释，测定时上述共存物质允许倍数均大于其在果汁饮料中的相对值，对罗丹明B的测定不会有明显的干扰。

2.5 样品测定及回收率实验

对市售的5种果汁饮料进行测定，均未检出罗丹明B。准确量取1.0mL果汁4份于4支50mL具塞离心管中做加标回收率实验，加标水平为0.1、0.2、0.4、0.8mg/L，混合均匀，密封放置1d，然后按1.3.1节对样品进行处理，每个平行测定6次，测得回收率为101.3%～113.7%，RSD为2.76%～4.98%。

3 结 论

本研究建立了以伊红Y为荧光探针测定果汁类饮料中罗丹明B残留量的荧光光谱法。该方法样品处理简单，操作简便，具有灵敏度高、选择性强、用样量少、检测时间短、检测成本低等优点。为罗丹明B残留量的检测提供了一种快速简便灵敏准确可靠的新检测方法。

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Rapid Determination of Rhodamine B Residues in Fruit Drink by Fluorescent Probe Assay

LIANG Yu1,2，HUANG Shi-jiang1，WANG Chao-hai2，CHENG Ding-xi1,*
(1. School of Chemistry and Environmental Science, Henan Normal University, Xinxiang 453007, China ；2. College of Chemistry and Chemical Engineering, Xinxiang University, Xinxiang 453003, China)

A new fluorescence spectrometr y method for the determination of rhodamine B (RhB) was established by the use of eosin Y (EY) as fluorescent probe. In Sфrensen buffer solution at pH 6.8, the fluorescence intensity of anionic dye EY can be significantly enhanced by adding cetyltrimethylammonium bromide (CTMAB), a cationic surfactant. However, RhB has the ability to quench the fluorescence in a proportional manner within a certain concentration range. In this study, one-factor-at-atime designs were used to determine the optimal experimental conditions for the determination of RhB. The linear range,detection limit and average recovery rate of the developed assay were 0－0.9 mg/L, 0.0016 mg/L, and 101.3%－113.7% with relative standard deviation of 2.76%－4.98%, respectively. This method is simple, quick, selective and sensitive so that it is suitable for the determination of RhB residues in fruit drink products.

fluorescent probe；eosin Y；rhodamine B；residue

O657.3

A

1002-6630(2012)18-0258-03

2012-05-20

河南省重点科技攻关项目(102102210043)

梁宇(1970—)，女，副教授，硕士，研究方向为环境分析。E-mail：sunrain732002@sina.com

*通信作者：程定玺(1964—)，男，教授，博士，研究方向为药物分析和食品添加剂及农药残留检测。E-mail：chengdingxi@yahoo.com.cn