氘代同位素内标-气相色谱-质谱法测定胆固醇含量鉴别地沟油的研究

许秀丽 任荷玲 李 娜 张凤霞 王 磊 安 娟 仲维科

(中国检验检疫科学研究院 北京 100123)

1 前言

地沟油是人们对于生活中的各类劣质油的统称，它主要包括三类:一是狭义的地沟油，即将下水道中的油腻漂浮物或者将宾馆、酒楼的剩饭、剩菜(通称泔水)经过简单加工、提炼出的油;二是劣质猪肉、猪内脏、猪皮加工以及提炼后产出的油;三是用于油炸食品的油使用次数超过规定次数后，再被重复使用或往其中添加一些新油后重新使用的油。地沟油不仅对人体危害极大，而且影响国计民生甚至影响到国家的国际形象，地沟油事件已经成为媒体关注、百姓关心、领导忧心的重大问题。但是到目前为止，还没有鉴别地沟油的有效方法。

本研究以地沟油生产的源头为出发点，即根据餐饮业废弃物中往往会含有大量的动物性成分，从中提取的地沟油不可避免地混有动物脂肪，也必定含有动物油脂的特征性甾醇——胆固醇。动植物组织中都含有甾醇，植物油中主要含有谷甾醇、豆甾醇、菜油甾醇等多种植物甾醇，而一般不含或含有极少量的胆固醇。因此通过测定油中胆固醇的含量，即可判定植物油中是否含有动物油脂，从而推断该油是否是地沟油或者混有地沟油。

目前，胆固醇测定常采用试剂盒［1］、生化分析仪［2］、荧光毛细分析法［3］、液相色谱法［4－6］、气相色谱法［7－8］、气相色谱质谱连用［9］、液相色谱质谱联用［10］等方法。试剂盒、生化分析仪及荧光毛细分析法灵敏度较低，选择性和特异性较差，不适于植物油中痕量胆固醇的含量分析。液相色谱和气相色谱方法，尤其液相色谱－质谱/质谱和气相色谱/质谱方法，灵敏度和特异性都比较高，但由于大多采用外标法，易受环境及仪器条件变化的影响进而影响准确度，同时其他同类甾醇类可能同时存在于植物油或地沟油基体中，导致方法的定量不准确。采用同位素内标法，可以较好的补偿样品预处理及检测过程中诸多因素对检测结果的影响。目前，尚无应用同位素内标法测定胆固醇含量鉴别地沟油的文献报道。

本研究利用同位素内标稀释－气相色谱－质谱(GC－MS)联用技术，建立了植物油及地沟油中胆固醇含量的精确分析方法，优化了前处理方法和色谱质谱条件，对比市售的108种各类植物油及公安部查封的23种地沟油中胆固醇的精确含量，发现地沟油与植物油的胆固醇含量差异。因此用胆固醇含量作为地沟油的一个衡量指标，将为地沟油的确证提供有效的依据。

2 材料与方法

2.1 材料

2.1.1 样品

108种植物油:均为在北京各大超市购买，包括花生油、大豆油、玉米油、橄榄油、食用调和油、葵花籽油等;地沟油:20多种地沟油均为公安部门查封的地沟油厂家生产或已经勾兑好准备销售的精炼地沟油;成品“地沟油”:经公安部门确认的已被犯罪分子在市场贩卖的“地沟油”样品;勾兑“地沟油”:实验室采用经公安部门确认的纯“地沟油”与阴性样本按一定比例进行勾兑的样本。实验室配制的勾兑“地沟油”的梯度分别为:阴性样本+50%纯“地沟油”，阴性样本+30%纯“地沟油”，阴性样本+20%纯“地沟油”，阴性样本+10%纯“地沟油”以及阴性样本+5%纯“地沟油”。

2.1.2 试剂

胆固醇标准品和氘代胆固醇－D6内标:Sigma;其他试剂:国产分析纯。

2.1.3 胆固醇标准溶液

准确称取胆固醇标准品1.0 mg，用正己烷溶解制成100.0 mg/L标准储备液，根据需要稀释成适当浓度的加有1.0 mg/L胆固醇D6内标的标准工作溶液，于4℃下保存。

2.1.4 仪器

7890N气相色谱－5975i质谱联用仪:配有电子轰击电离源(EI)和7683型自动进样器，美国Agilent公司;12管防交叉污染SPE装置:美国SUPELCO公司;MS2涡旋混合器:德国 IKA公司;N－1000VW旋转蒸发仪:日本EYELA公司。

2.2 方法

2.2.1 样品前处理

2.2.1.1 皂化法

2.2.1.1.1 皂化

称取试样0.5g(±0.01g)于50mL聚四氟乙烯离心管中，加入10mL 2mol/L KOH－乙醇溶液，涡旋2min，振荡10min，置于65℃恒温振荡水浴中皂化60min。

2.2.1.1.2 提取

向离心管中加入饱和NaCl水溶液4mL、正己烷10mL，振荡提取10min，于10000 rpm 离心3 min。吸取上层清液于50mL聚四氟乙烯离心管A中。再加入正己烷10mL，重复提取1次。合并上清液于50mL聚四氟乙烯离心管A中，加入2%Na2SO4水溶液10mL，涡旋2min，10000 rpm 离心3 min，上层有机相过无水Na2SO4后转移至梨形瓶中，并浓缩至近干，用正己烷定容至2mL，待GC/MS检测。

2.2.1.2 SPE 法

2.2.1.2.1 样品准备/提取

称取试样0.5 g(±0.01 g)于10mL具塞比色管中，用5mL正己烷溶解，作为上样溶液待净化。

2.2.1.2.2 SPE 柱净化

(1)活化:加入10 mL正己烷，弃去流出液;(2)上样:加入待净化液，弃去流出液;

(3)淋洗:加入10 mL 5%乙醚－正己烷(V/V)，弃去流出液;

(4)洗脱:加入15 mL 10% 乙醚－正己烷(V/V)，收集流出液，于40℃减压蒸干，用正己烷定容至1mL，待GC/MS检测。

2.2.2 GC/MS 测定条件

2.2.2.1 色谱条件

色谱柱:DB－5MS石英毛细柱(30m×0.25mm×0.25μm);进样口温度:280℃;不分流进样模式，不分流时间:1.00 min;升温程序:初始温度220℃，保持2 min，以30℃/min升至280℃，保持12 min;载气(He)流速:l.2 mL/min。

2.2.2.2 质谱条件

EI电离方式，电子能量 70eV;离子源温度250℃;电子倍增器电压1605 V;质量扫描范围M/Z 190－450;传输线温度为270℃。选择离子(SIM)方式时:氘代胆固醇内标:M/Z 392，377，355;胆固醇:M/Z 386，368，301，213。

3 结果与讨论

3.1 样品前处理方法的选择

采用皂化和固相萃取(SPE)两种方法对植物油与地沟油中的胆固醇进行提取，两种方法的测定结果基本一致。但SPE法的干扰色谱峰明显少于皂化法，见图1和图2，研究表明SPE去除基质干扰更充分。同时具有操作更加简单、回收率更稳定的特点。因此，采用SPE法处理样品。

图1 皂化法的D12号地沟油样品选择离子谱图

图2 SPE前处理方法的D12号地沟油样品选择离子谱图

3.2 方法评价

在实验中利用气相色谱－质谱技术，分别采用内标法和外标法对植物油样品中胆固醇进行回收率比较。结果表明，使用外标法时其回收率为70.5% －91.6%，平均回收率为82.1%，而用内标法定量时，其回收率为93.5% －99.5%，平均回收率为 96.0%;内标法的定量回收率略高于外标法;外标法最低检出限为0.5mg/kg，与内标法的0.2 mg/kg 相比，稍有差别，这主要是由于外标法抗环境与仪器检测条件变化能力不如内标法所致;外标法的线性范围为0.5 －50.0 mg/kg，与内标法的0.2 －20.0 mg/kg 相比，主要是由于检出限的差异引起的线性范围低限的差别。总体而言，同位素内标法比外标法具有更好的准确性。

本实验采用内标标准曲线法定量。配置浓度为 0.1、0.2、0.5、1.0、5.0、10.0 mg/L 胆固醇标准溶液，其中每份内含1.0 mg/L胆固醇－D6内标溶液。GC/MS/SIM测定后，以胆固醇与内标物的胆固醇定量离子峰面积比值为纵坐标，标准溶液浓度为横坐标做图，得到内标标准工作曲线。结果表明，胆固醇在0.1－10.0 mg/L范围内线性关系良好，线性方程为，相关系数为0.9998。

3.3 植物油中胆固醇含量对比分析

按上述建立的实验方法，对108种市场购买来的品牌植物油进行了胆固醇含量对比。每个样品平行前处理3次，胆固醇－D6内标法定量，结果见表1。

表1 108种植物油胆固醇测定平均值及稳定性RSD(n=3)

(续表)

(续表)

表1显示，每种植物油的胆固醇值含量差别不大，例如12种花生油胆固醇值在1.49－2.98 mg/kg，7 种大豆油的胆固醇含量在 5.36 －11.65 mg/kg，普遍高于花生油。但总结108种市售植物油的胆固醇值可得出，除2种亚麻籽油和2种菜籽油胆固醇值较高，在19.41－28.26 mg/kg的水平，其余包括深海鱼油调和油(胆固醇值为12.76 mg/kg)在内的97种食用油的胆固醇值均低于15.0 mg/kg，且绝大多数食用油的胆固醇值低于10.0 mg/kg。

3.4 地沟油中胆固醇含量分析

各地公安部门查获的地沟油共23种，按以上建立的方法测定胆固醇含量，见表2。

表2 地沟油中胆固醇平均含量及测定相对标准偏差(n=3)

D14 地沟油 14 204.67 4.65 D15 地沟油 15 241.70 0.56 D16 地沟油 16 190.43 1.24 D17 地沟油 17 8.22 6.32 D18 地沟油 18 86.42 5.26 D19 地沟油 19 8.11 3.21 D20 地沟油 20 7.58 5.32 D21 地沟油 21 33.63 4.28 D22 地沟油 22 41.43 5.09 D23 地沟油23 36.83 2.45

从表2可见，23种地沟油中除D17、D19和D20三种地沟油外，胆固醇含量均在24.0 mg/kg以上，甚至高达599.30 mg/kg，是108种植物油的几十至上百倍。根据胆固醇含量的测定值，可以明确判定其为地沟油。3种胆固醇含量较低的地沟油为贴好标签准备市售的精炼地沟油，其标签明确标识为某品牌“花生油”标签，但根据对植物油的对比结果，花生油的胆固醇值含量极低，在1.49－2.98 mg/kg，而3种地沟油的胆固醇含量值则分别为8.22、8.11和7.58 mg/kg，为测定值的 4倍。据此，可以怀疑此“花生油”可疑，应为勾兑地沟油。

3.5 典型植物油和地沟油中胆固醇检出标准谱图见图4和图5。

3.6 地沟油与植物油不同勾兑比例时的胆固醇测定含量

图4 地沟油样品中胆固醇标准谱图(12.22min为胆固醇)

图5 植物油样品中胆固醇的标准谱图(12.20 min为胆固醇)

D12号格林地沟油为从地沟油加工生产企业直接取回的典型地沟油，颜色清亮，外观与普通食用植物油差异不大。为了测定地沟油与植物油不同勾兑比例时的胆固醇含量，选择D12号格林地沟油与1号植物油(压榨1级花生油)不同勾兑比例进行测定。地沟油所占比例分别为50%、30%、20%、10%和5%，理论计算值与实际测定值见表3。从表3中可见，实际测定值与理论计算值基本相当。图6给出了地沟油勾兑含量为50%、20%和10%时胆固醇检测谱图，从图中可以看出地沟油含量不同时，胆固醇含量呈梯度变化。同时可以看出，在地沟油勾兑比例为5%时，测定值8.85 mg/kg，相当于D19和D20“花生地沟油”的胆固醇水平，是测定花生油样品中胆固醇含量的4倍。因此该检测方法目前可检测到典型地沟油勾兑到5%的水平。

表3 D12号地沟油与1号植物油不同勾兑比例时的测定值与理论值

G3 勾兑20%地沟油D14 30.51 29.53 G4 勾兑30%地沟油D15 42.91 43.16 G5 勾兑50%地沟油D16 70.90 70.42 D12 格林地沟油138.56 /

4 结论

利用建立的SPE－氘代同位素内标－GC/MS检测方法，对比了108种市售品牌植物油与23种地沟油样品中胆固醇含量，结果显示地沟油中胆固醇含量是植物油中含量的几十到几百倍，表明利用胆固醇含量检测方法，可明确判别地沟油加工厂生产的地沟油。

同时，发现同一种类植物油样品中胆固醇含量差别不大。通过对不同比例勾兑地沟油(比例分别为50%、30%、20%、10%和5%)的结果显示，勾兑5%地沟油的花生油样品中胆固醇含量仍高于市售花生油样品中胆固醇含量的4倍，可判定其为勾兑的地沟油样品。

应用该鉴别地沟油方法，参加了两次卫生部组织的盲样考核，阴性准确率分别为89%和60%，阳性准确率分别为93%和91%。表明该检测方法可以作为地沟油鉴别方法之一，有助于解决当前棘手的地沟油检测难题。

图6 地沟油勾兑含量为50%，20%和10%时胆固醇检测谱图

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