微量胃黏膜IL－1βmRNA水平Real－time PCR检测方法的建立

李 娟，嘉红云，王忠英，周 强，王方金，何蕴韶，吴晓蔓

（1.广州医学院第二附属医院 检 验科，广东 广 州510260；2.中山大学达安基因诊断中心，广东 广 州510080）

IL－1β是胃肠道疾病发生发展的重要影响因素，可能在慢性胃炎－胃粘膜萎缩－不典型增生－胃癌这一发病模式中起了先导作用［1］。胃粘膜IL－1β的高水平表达可引起炎症程度的增加及胃酸分泌的减少，不加干预则有可能发展成萎缩性胃炎甚至胃癌；IL－1β低表达则与胃酸分泌过多相关，有可能引发十二指肠溃疡［2－3］。明确儿童时期胃粘膜IL－1β的表达量有利于进一步研究IL－1β在疾病发展过程及预后、转归中的作用。本研究将建立微量胃粘膜IL－1βmRNA 表达水平的 Real－time PCR 检测法，为IL－1β在胃肠道疾病发生发展过程中作用的研究提供有力工具。

1 材料与方法

1.1 材料 20例随机选取的有消化道症状患儿（≤14岁）的胃粘膜标本用来做本次研究。胃粘膜标本由达安基因诊断中心提供。

1.2 主要试剂与仪器 RNA核酸提取试剂盒（德国qiagen公司），Taq酶、Buffer，MgCl250 mmol／L（MBI Fermentas公司），p MD－18T 载体试剂盒（大连宝生物工程公司）。7500荧光定量PCR扩增仪（美国ABI公司）。

1.3 引物探针设计 在生物数据库GENEBANK中找到目的基因IL－1β及内参基因GAPDH的mRNA序列，运用生物软件Primer 5，Primer Expreess辅助设计引物探针，为避免基因组DNA序列的干扰，探针所在的位置均跨内含子，引物探针序列见表1。

1.4 cDNA的生成 用提取的总RNA做模板，使用随机引物经逆转录（Reverse transcript，RT）生成cDNA，逆转录反应体系见表2。

表1 引物探针序列

表2 逆转录反应体系组成

反应条件：37℃60 min，95℃5 min灭活逆转录酶。最后将c DNA置－20℃保存备用。

1.5 IL－1β、GAPDH real－time反应体系及条件 见表3。

表3 Real－time PCR 反应体系

反应条件：95℃3分钟预变性，然后95℃45秒，55℃1分钟，扩增10个循环，再95℃30秒，55℃45秒，扩增30个循环。反应在Applied Biosystems 7500上进行，由PCR仪7500附带的软件ddCT study自动分析IL－1β表达水平。

2 方法验证

2.1 引物特异性确证 IL－1β、GAPDH基因相应的PCR产物用p MD－18T载体试剂盒做克隆，菌液送交上海英骏生物技术公司测序，测序结果经BLAST比对确认了所设计引物的特异性扩增能力。

2.2 IL－1β、GAPDH反应体系扩增效率的检测 将克隆所得菌液按10倍浓度稀释，得到5个浓度梯度的IL－1β及GAPDH菌液（109～105拷贝／ul）。以稀释后的菌液为模板进行real－time PCR反应，取△CT值做回归分析：

回归曲线的斜率为0.0023，表明本实验所用IL－1β、GAPDH PCR反应体系的扩增效率一致，可以用GAPDH做内参来检测IL－1βmRNA的表达水平。可见不同模板浓度的对数值与CT值间有非常好的线性关系，标准曲线的回归系数均大于0.99（图略）。

2.3 胃粘膜标本IL－1β、GAPDH mRNA 的检测每份样本cDNA 的IL－1β、GAPDH real－time PCR扩增均做三个平行复孔，GAPDH及IL－1β的复孔检测均有较好的重现性。所有接受检查的20例儿童胃粘膜标本经分析都得到了IL－1βm RNA的相对表达值，见表4。

3 讨论

IL－1β是抑制胃酸分泌的强有力的前炎症因子［4］，IL－1βmRNA 高表达，胃酸分泌减少，利于细菌定植，IL－1βm RNA表达增高可能是胃萎缩、胃癌发生的起始因素。IL－1βm RNA低表达，胃酸分泌增多，则会导致十二指肠溃疡的发生。由此可见IL－1βmRNA表达水平对胃肠道疾病的发生发展有着重要的影响。成人中研究发现无论是H.pylori的感染还是IL－1基因簇的多态性都一定程度的影响着IL－1β的表达［5－6］，这些影响因素是否在儿童时期就发挥着显著的作用，尚不明确，需要进一步研究。在对儿童进行消化道内镜检测时，钳取的粘膜量较少，需要高灵敏度的检测方法来确定其胃粘膜IL－1β mRNA的表达量。Real－time PCR检测法的灵敏度高，特异性强［7－8］。因此，本研究着力于建立微量胃粘膜IL－1βm RNA 表达水平 Real－time PCR 检测法。检测原理如下［9］：

表4 胃粘膜IL－1βmRNA检测相关数值

dd CT即2－△△CT是一种检测目的基因表达水平的相对定量方法，多选取GAPDH 、β－actin等看家基因做内参，检测目的基因相对于看家基因的表达量，之后用标准品做校准就可以得到目的基因的相对定量值，继而可以比较不同样本或组别表达水平的差异。ddCT法的推导过程如下［9］：

用Xn表示第n个循环后的目的基因产物量，X0表示初始目的基因量，Ex表示目的基因的扩增效率，n表示循环数，则：Xn＝X0×（1＋EX）n。

用XT表示目的基因达到设定的阈值时的产物量，CTX表示目的基因扩增达到阈值时的循环数，则：XT＝X0×（1＋EX）CT，X＝KX，Kx为一常数。XT表示目的基因达到设定的阈值时的产物量，CT，X表示目的基因扩增达到阈值时的循环数对内参基因R（endogenous reference），亦有同样的公式，即 RT＝R0×（1＋ER）CT，R＝KR，KR为一常数。RT表示内参基因达到设定的阈值时的产物量，R0表示初始内参基因量，ER表示内参基因的扩增效率，CT，R表示内参基因扩增达到阈值时的循环数。

目的基因的产物量XT除以内参基因的产物量RT得

对于使用Taqman探针的实时扩增而言，XT和RT的值由一系列因素决定：包括探针所带的荧光报道基团、探针序列对探针荧光特性的影响、探针的水解效率和纯度以及荧光阈值的设定。因此常数K并不一定等于1。假设目的基因与内参基因的扩增效率相同，即＝K或XN×（1＋E）△CT＝K，这里的 XN是就（X0／R0）标准化处理过的初始目标分子量；△CT表示目的基因和内参基因CT值的差异即CTX－CTR。整理得XN＝K×（1＋E）－△CT。

最后用标准品calibrator（cb）的XN校准任一样本q的 XN，XN，q除以 XN，cb得：

对于少于150 bp的扩增片断，如果Mg2＋浓度、引物都进行了适当的优化，扩增效率接近于1。因此目的基因经内参及calibrator校准后的量即为

运用建立好的检测方法成功获得了20例儿童消化道内镜检测时钳取胃粘膜的IL－1βm RNA相对表达量。本次研究建立的微量胃粘膜IL－1βmRNA表达水平Real－time PCR检测法，将有助于进一步研究IL－1β在胃肠道疾病发生、发展过程中的作用，特别是在标本量少，IL－1β表达量低的情况下。

此外，IL－1β在个体对多种抗原的侵入反应中发挥作用，它可以提高个体对各种内源性及外源性刺激的免疫力。IL－1β的广谱生物学作用源自它所介导的许多其它基因的表达如：TNF－α，interferonα，β.γ，c－myc，c－jun，and c－fos［1］，精确定量IL－1β表达还有助于研究它对相关基因的调节作用，本文所建立的方法对血液、体液等微量标本IL－1βmRNA表达水平的检测同样适用。

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