富组蛋白1促进创面愈合的实验研究

富组蛋白是人类腮腺和颌下腺分泌的一组富含组氨酸的阳离子多肽（Histatins），长度为7个～38个氨基酸残基，Hist 1、Hist 3、Hist 5是其中最重要的3种，占富组蛋白总含量的85%～90%，具有广谱抗菌及抗真菌作用，也被称为抗菌肽，是口腔局部固有防御系统的重要组成部分[1－3]。Menno等[4]通过研究发现，富组蛋白家族尤其是 Hist 1和Hist 2对口腔黏膜上皮细胞具有显著的促迁移功能，认为它是促进口腔创面愈合的主要刺激因素；而Histatins只存在于口腔局部系统中，对人体非口腔上皮创面是否也有此作用，本实验以表皮细胞为例，探讨富组蛋白对表皮创面愈合是否有促进作用。烧伤病人晚期残余创面迁延不愈，是目前烧伤治疗中比较困难的问题[5]。而创面护理贯穿烧伤治疗的全过程，所以做好创面护理非常重要。目前，使用较多的方法是湿润烧伤膏（MEBO）暴露疗法，但护创敷料涂药厚度厚，药耗量大，换药间隔时间短，并且换药时需用1%苯扎溴铵溶液洗净创面再涂药[6]。还有临床常见的糖尿病足、压疮溃疡的护理，如果在创面护理中应用富组蛋白，既能预防感染又能促进创面愈合，为创面护理提供了新的思路。

1 材料与方法

1.1 主要材料 人工合成富组蛋白1，表皮细胞标准细胞株，1640表皮细胞培养基，牛血清，0.25%胰酶，PBS缓冲液，倒置显微镜，细胞培养箱，普通光学显微镜，电子天平，超净工作台，离心机。

1.2 实验方法 采用细胞划痕法。将长至90%满的表皮细胞，用0.25%胰酶消化，离心，于培养板底部中央做十字形标记后，接种表皮细胞于24孔培养板内，分 Hist 1实验组、空白对照组、Hist 1＋丝裂霉素实验组、空白＋丝裂霉素对照组（丝裂霉素控制细胞增殖的影响），当细胞单层铺满融合时，用10μL／mL丝裂霉素处理2h后，用无菌200μL移液枪枪头在培养板底部沿十字形标记划痕建立体外细胞损伤模型，PBS冲洗划痕区残留细胞。实验组各加入250μL含30 μg／mL Hist1、1640低血清（1%牛血清）培养液，对照组加1640低血清培养液。

在倒置显微镜下，每个划痕区利用显微标尺选择1mm范围内划痕区，分别于0h、16h、24h测量，利用image tool软件计算愈合面积。

2 结果

2.1 富组蛋白1对表皮细胞创面愈合的影响 与空白对照组比较，富组蛋白1能明显促进表皮细胞增殖和迁移，且随着时间延长愈合率增加。详见表1。

表1 两组表皮细胞创面愈合率比较（±s） %

表1 两组表皮细胞创面愈合率比较（±s） %

组别 16h愈合率 24h 64.60±10.1271.42±8.44空白对照组 41.23±4.52 48.11±3.94 t值 4.215 5.愈合率Hist 1实验组004 P＜0.05 ＜0.05

2.2 富组蛋白1对表皮细胞迁移能力的影响

2.2.1 Hist1实验组0h16h24h细胞迁移情况（见图1）

2.2.2 空白＋丝裂霉素对照组0h、16 h、24h细胞迁移情况（见图2）

2.3 经丝裂霉素处理后两组表皮细胞创面愈合率 表皮细胞经过丝裂霉素处理，抑制了其增殖能力，可见富组蛋白1能促进表皮细胞迁移。详见表2。

表2 经丝裂霉素处理后两组表皮细胞创面愈合率比较（±s） %

表2 经丝裂霉素处理后两组表皮细胞创面愈合率比较（±s） %

愈合率Hist 1＋丝裂霉素实验组组别 16h愈合率 24h 61.97±10.76 67.36±10.39空白＋丝裂霉素对照组 32.25±2.98 37.65±4.69 t值 5.32 5.21 P＜0.05 ＜0.05

3 讨论

3.1 富组蛋白1能促进非口腔上皮创面愈合，耗药量少，换药间隔时间长 由图1可以看出，富组蛋白能明显促进表皮细胞即非口腔黏膜上皮迁移，为皮肤创面护理提供了新的途径。现在常用的MEBO暴露疗法，涂药厚度要求0.5 mm～1.0mm，换药间隔时间要求6h～8 h，换药同时还要常规对创面周围用0.1%苯扎溴铵或75%乙醇消毒，避免交叉感染[7]。而30μg／mL的 Hist1在唾液的生理浓度中就能发挥创面愈合作用。本实验前期研究发现，16h表皮细胞迁移活性比8h明显增强，创面愈合率高。图1、图2显示，24h愈合率与16h相比变化不大，因为16h～24h期间没换药，实验证明如果16h后换药，24h愈合率可以达到100%。由丝裂霉素处理后空白组0h、16h、24h细胞迁移情况看出未加Hist1的表皮细胞迁移缓慢，24h细胞愈合率只有37.65%，但以什么样的形式（粉末、液体、喷雾）用作创面敷料及换药方法还需下一步临床试验验证。

3.2 富组蛋白1用于创面护理，既能提高创面愈合率，又能节约护理成本，减轻护理人员劳动强度 富组蛋白一直作为抗菌肽被人们熟识，既能对抗普通细菌又能对抗真菌、衣原体等，具有广谱抗菌作用，现在看来它既能抗感染又能促进创面愈合，因为Histins的参与，同样的伤口，口腔黏膜上皮愈合只需7d，而皮肤却要几个星期[8，9]。早期创面处理的好坏是创面治疗成败的关键。本实验从表皮细胞划痕即制造创面之初就加入Hist1干预，烧伤、创伤创面早期有炎性渗出，糖尿病足、压疮早期有表皮破损，如不及时干预将加大护理难度和人力物力成本，尤其是长期卧床或保持功能体位者，此时，只需及时用药和理疗，即可减少毒性物质的吸收，抵抗感染，维护创面清洁环境，促进愈合。本实验结果显示，大约1.4mm2的创面16h愈合率为64.60%，24h愈合率为71.42%，如果期间换药愈合率还可以增加。尤其是较深创面如压疮的溃疡期、糖尿病足晚期、深度烧伤很容易导致真菌感染，而抗真菌药又有较强的副反应，再加上抗生素的大量应用，耐药菌株多[10]。富组蛋白耐药性小，抗感染能力强，量加大也没有毒性反应[4]。在创面愈合后期，Hist1能促进表皮细胞向创面中央区域迁移促进表皮愈合，从表2可看出，1.4mm2的创面16h愈合率达到61.97%，远高于对照组。所以，富组蛋白在创面早期和晚期都能发挥较强的促愈合作用，能节约护理成本，减轻护理人员劳动强度。今后还需与MEBO暴露疗法等常用的创面护理方法作对照实验，确定优劣性和可操作性。

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