DRD1基因和OPRM1基因功能区多态性与海洛因依赖的关系

侯巧芳 贾 伟 张 蕊 吴 东 刘清波 廖世秀▲

1.河南省人民医院医学遗传研究所，河南郑州 450003；2.陕西省西安市精神卫生中心，陕西西安 710061；3.西安交通大学医学院法医系，陕西西安 710061

DRD1基因和OPRM1基因功能区多态性与海洛因依赖的关系

侯巧芳1贾 伟2张 蕊2吴 东1刘清波3廖世秀1▲

1.河南省人民医院医学遗传研究所，河南郑州 450003；2.陕西省西安市精神卫生中心，陕西西安 710061；3.西安交通大学医学院法医系，陕西西安 710061

目的 探讨物质依赖候选基因多巴胺D1受体（Dopamine receptor D1，DRD1）和μ阿片受体（μ-Opioid receptor，OPRM1）基因多态性与海洛因依赖之间是否存在关联。方法 采用直接测序的方法对中国西安汉族海洛因依赖者和正常对照群体的DRD1和OPRM1基因进行检测，并对OPRM1基因的rs1799971位点与海洛因依赖关联研究进行了 Meta分析。结果 DRD1基因共发现 rs1799914、rs4532、rs5326 3个多态性位点，OPRM1基因共发现rs1799971和rs6912029两个多态性位点；关联分析未发现这5个单核苷酸多态性位点与海洛因依赖之间存在关联；Meta分析结果也不支持OPRM1基因的A118G多态性位点与海洛因依赖的关联性，但这一结果尚未能排除基因上位性效应的可能影响。结论 rs1799914、rs4532、rs5326、rs1799971和rs6912029位点及其构成的单倍型与海洛因依赖之间可能不存在关联。

海洛因依赖；多巴胺受体；阿片受体；单核苷酸多态性；关联研究

遗传原因造成药物精神依赖的个体易感性差异[1]。μ阿片受体（OPRM1）是海洛因等多数阿片类物质产生躯体依赖、戒断症状、条件性位置偏爱等反应的分子基础[2]。研究发现，OPRM1基因的单核苷酸多态性 （Single Nucleotide Polymorphism，SNP）影响受体的结合力和信号转导[2-3]。单胺能通路中，多巴胺能投射是中脑-皮质-边缘系统即奖赏中枢的神经物质基础，多巴胺受体 D1（DRD1）、D2（DRD2）可能都参与药物依赖的强化、奖赏、动机调控和行为敏感化。本研究以O PRM1和DRD1基因5’端调控区和第一外显子为目标，利用直接测序的方法，分析这一段区域在中国西安汉族人群中的多态性分布情况，并通过病例-对照分析探索是否存在与海洛因依赖相关联的多态性位点。

1 资料与方法

1.1 一般资料

病例组为2009年10月～2011年2月在西安市精神卫生中心接受美沙酮维持治疗的海洛因依赖者，共102名，男90 名，女 12 名，平均年龄为（37.66±4.21）岁，吸毒史（10.64±3.35）年。入组标准：（1）符合DSM-IV阿片类物质依赖诊断标准；（2）入组时尿吗啡试验阳性；（3）海洛因成瘾1年以上，曾多次脱毒（≥2）；（4）无其他药物滥用。对照组120名健康人来源于西安市中心血站，男103名，女17名，平均年龄为（31.66±2.43）岁，经调查无成瘾性药物使用史（香烟和酒精分别按照平均每天使用量小于5支和50 g作为标准）。两组均排除严重呼吸、循环等内科及其他精神科疾病。所有样本为无亲缘关系西安汉族，样本采集符合“知情同意”的原则。由于DNA样本质量或测序质量等原因，最终成功分型的样本数各个位点之间略有差别。

1.2 方法

1.2.1 基因组DNA提取、扩增及测序 盐析法提取全血基因组DNA。引物由北京奥科生物技术有限公司合成，DRD1正向和反向扩增引物分别为：5'TCCGAAACGTTGAGGAAGCG 3'和 5'GGAGGGCAAGCACTCACCG 3'；OPRM1 正向和反向扩增引物分别为：5'TGAT GAGCCTCTGTGAACTAC3'和5'CTTAAGCCGCTGAACCCT3'。PCR反应体系：为2×Taq PCR Mix 15 μL、引物 100 nmol/L、DNA 模板约 100 ng，去离子水补足体积至30 μL。PCR反应条件：预变性 95℃，5 min；95℃变性 30 s、64℃退火 40 s（OPRM1 基因为 60℃退火 40 s）、72℃延伸 50 s；72℃总延伸，10 min。PCR 产物经纯化、双向测序扩增后，由ABI 3730 DNA序列分析仪直接测序。

1.2.2 统计分析 利用DNAMAN软件包对测序峰图进行序列判读及比对；SPSS 13.0软件包进行哈迪温伯格 （Hardy-Weinberg，HWE）平衡检验、基因、基因型频率及关联性检验；Haploview软件进行单倍型重构及单倍型关联分析。ReviewManage4.2（Oxford England）软件进行 Meta分析。

2 结果

2.1 DRD1、OPRM1基因SNP多态性分析

本次研究中，DRD1 共发现 rs1799914 （240T/C）、rs4532（485 C/T）、rs5326 （531T/C）3 个位点在西安汉族人群中具有多态性。OPRM1共发现rs1799971（A118G）和rs6912029（G172T）两个位点具有多态性（见图1、2）。 rs1799914、rs4532、rs5326、rs1799971、rs6912029位点在人群中的分布均符合HWE，最小等位基因频率分别为 0.043、0.169、0.266、0.088、0.317，均大于或接近5%，在人群中的分布具有多态性（见表1）。

2.2 多态性位点的关联分析

2.2.1 等位基因、基因型在海洛因依赖及对照人群中的关联分析 对 rs1799914、rs4532、rs532、rs1799971、rs6912029 的等位基因、基因型在对照组和海洛因依赖组之间的分布进行关联分析，5个位点χ2检验P值均大于0.05，表明这5个SNP位点在海洛因依赖组和健康对照组之间的分布差异均无统计学意义（见表2、3）。

表1 多态性位点HWE检验及群体遗传学基本信息

表2 DRD1基因 rs1799914、rs4532、rs532位点在海洛因依赖及对照人群中的关联分析

表3 rs6912029、rs1799971在海洛因依赖及对照人群中的关联分析

2.2.2 DRD1及OPRM1单倍型关联分析 使用Haploview4.1软件分别对DRD1和OPRM1的SNP位点进行连锁不平衡及单倍型关联分析。为了避免多重检验所带来的统计学偏倚，利用置换检验对所得χ2检验P值进行修正检验，置换次数设置为10 000次。χ2检验和置换检验结果表明DRD1 3个SNP位点构成的4种单倍型，OPRM1两个SNP构成的3种单倍型分布在海洛因依赖组和正常对照组之间差异无统计学意义。

3 讨论

DRD1基因被认为是精神依赖性物质、孤独症、精神分裂症等多种精神类疾病的候选基因。rs4532位点的关联研究则比较广泛且令人关注，在孤独症研究中，研究者发现rs4532 AA基因型与孤独症相关联，并且与其他位点以单倍型的形式影响患者社会适应能力、刻板症等行为[4]，并且该位点与DRD2多态性位点之间存在交互作用，共同影响部分药物依赖行为特征[5]。而 DRD1 rs4532（485 C/T）和rs1799914（40T/C）与海洛因依赖的关联研究尚未见其他报道。但是DRD1基因rs4532多态性位点在精神分裂症、美沙酮耐受等精神药物反应的关联研究中却有阳性发现[6-7]。因此笔者推测，本实验的阴性关联结果可能是因为选择的群体不同、药物不同；或者这两个位点可能通过与其他基因共同作用，参与调控海洛因依赖的某些特殊行为特征，如渴求、复吸等具有刻板症特征的行为。这将是以后研究的方向和注意点。

人们对于OPRM1 rs1799971（A118G）位点的研究兴趣由来已久。Bond C等[3]1998年报道，A118G Asp40（G/G）等位基因与β-内啡肽亲和力是Asn40（A/A）等位基因的3倍。Drakenberg K等[8]对海洛因依赖者尸体脑组织的分析表明OPRM1 118G个体中前脑啡肽原和前脑啡肽原基因的下调表现突出，该研究小组认为，118G个体通过改变阿片神经肽系统曾强了阿片类物质依赖的易感性。但是，在本研究中，OPRM1 rs1799971（A118G）和 rs6912029（G172T）位点基因型与等位基因的分布在海洛因依赖组和健康对照组之间不存在差异，基于单体型的关联分析结果即便是在进行置换检验后仍远大于0.05。这种阴性结果同样也在Gelernter J等[9]、苑成梅等[10]、杜江等[11]、Arias A[12]等的研究中存在。 但是，值得特别注意的是，杜江等的一项研究结果表明，A118G多态性与海洛因依赖无阳性关联，但是在酒精依赖组的分析却认为该位点G等位基因可能是酒精依赖的危险因素。对于这个结论与脑神经生化研究的结果相悖离现象，Albert Arias认为这可能与各个研究对于对照人群的设立缺乏严格、一致的标准有关，部分对照人群的选取未能排除烟、酒精依赖者。此外笔者认为该结果可能还受到以下几个方面的影响：（1）临床异质性。海洛因依赖是突出表现为慢性脑病的全身性复杂疾病，同时包含多种精神神经表型的改变，比较粗略的表型-基因关联研究可能影响结果的准确性。（2）基因-基因、基因-环境交互作用。复杂疾病存在多个微效基因，因此，所研究位点的参与度可能受到其他遗传因素及不同环境因素的影响。（3）随机因素的影响。关联分析样本量较低、对照样本的匹配程度等。（4）基因上位性效应可能存在。由于与神经生化研究的结果相悖，Albert Arias认为，这种情况下应当排除海洛因依赖中基因上位性效应的存在，但目前尚未见到该方面的报道。

本研究未发现DRD1基因rs1799914、rs4532、rs5326位点，OPRM1基因rs1799971和rs6912029位点与海洛因依赖的关联性。但是，这些位点对神经生化改变的影响，以及是否存在与其他基因或者位点的交互作用，尚有待进一步研究。

[1]Uhl GR.Molecular genetic underpinnings of human substance abuse vulnerability：likely contributions to understanding addiction as a mnemonic process[J].Neuropharmacology，2004，47（Suppl 1）：140-147.

[2]Mague SD，Blendy JA.OPRM1 SNP （A118G）：Involvement in disease development，treatment response，and animal models[J].Drug Alcohol Depend，2010，108（3）：172-182.

[3]Bond C，La Forge KS，Tian M，et al.Single-nucleotide polymorphism in the human mu opioid receptor gene alters beta-endorphin binding and activity：possible implications for opiate addiction[J].Proc Natl Acad Sci USA，1998，95（16）：9608-9613.

[4]Luo X，Kranzler HR，Zuo L，et al.Multiple ADH genes modulate risk for drug dependence in both African and European-Americans[J].Hum Mol Genet，2007，16（4）：380-390.

[5]Hettinger JA，Liu X，Schwartz CE，et al.A DRD1 haplotype is associated with risk for autism spectrum disorders in male-only affected sib-pair families[J].Am J Med Genet B Neuropsychiatr Genet，2008，147（5）：628-636.

[6]Crettol S，Besson J，Croquette-Krokar M，et al.Association of dopamine and opioid receptor genetic polymorphisms with response to methadone maintenance treatment[J].Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry，2008，32（7）：1722-1727.

[7]Zhu F，Yan CX，Wang Q.An association study between dopamine D1 receptor gene polymorphisms and the risk of schizophrenia[J].Brain Res，2011，28（1420）：106-113.

[8]Drakenberg K，Nikoshkov A，Horvath MC，et al.Mu opioid receptor A118G polymorphism in association with striatal opioid neuropeptide gene expression in heroin abusers[J].Proc Natl Acad Sci USA，2006，103（20）：7883-7888.

[9]Gelernter J，Kranzler H，Cubells J.Genetics of two mu opioid receptor gene （OPRM1） exon I polymorphisms：population studies，and allele frequencies in alcohol-and drug-dependent subjects[J].Mol 16.Psychiatry，1999，4（5）：476-483.

[10]苑成梅，方贻儒，赵敏，等.海洛因依赖临床特征与μ阿片受体基因多态的关联[J].中国药物依赖性杂志，2004，13（1）：22-25.

[11]杜江，谢斌，崔东红，等.Mu阿片受体多态性与海洛因依赖的关联研究[J].临床精神病学杂志，2007，17（2）：73-75.

[12]Arias A，Feinn R，Kranzler HR.Association of an Asn40Asp （A118G）polymorphism in the mu-opioid receptor gene with substance dependence：a meta-analysis[J].Drug Alcohol Depend，2006，83（3）：262-268.

Potential association of Dopamine Receptor D1 and μ-Opioid Receptor gene variation with heroin dependenc

HOU Qiaofang1JIA Wei2ZHANG Rui2WU Dong1LIU Qingbo3LIAO Shixiu1▲
1.Institute of Medical Genetics,Henan Provincial People's Hospital,Zhengzhou 450003,China;2.Xi'an Mental Health Centre,Xi'an 710061,China;3.Institued of Forensic Science,Xi'an Jiao Tong University,Xi'an 710061,China;

Objective To detect the polymorphism of the Dopamine receptor D1(DRD1)gene and μ-Opioid receptor(OPRM1)gene.And explore the potential association between the polymorphism loci and heroin dependence.Methods In the study,5’UTR and exon 1 of the DRD1 and OPRM1 gene sequenc were detected by direct sequencing method in 102 heroin-addicted individuals and 120 control subjects.Then case-control association analysis and Meta analysis were performed.Results Three SNP loci as rs1799914、rs4532 and rs5326 and two SNP loci as rs1799971 (A118G)and rs6912029 were found in DRD1 gene and OPRM1 respectivly in the studied population.But there were no evidence demonstrates the association relationship between any locus or haplotype and heroin dependence status.Moreover,the Meta-analysis of the association between OPRM1 A118G and heroin dependence suggested no association.But this results connot excluded the possibility epistasis effects.Conclusion There may not exists association between rs1799914,rs4532,rs5326,rs1799971,rs6912029 locus and heroin dependence even considered with the constructed haplotypes.

Heroin dependence;Dopamine receptor D1;μ-Opioid receptor;Single Nucleotide Polymorphism;Association study

R749.6

A

1674-4721（2012）08（c）-0008-03

▲通讯作者

2012-05-08 本文编辑：赵丽萍）