石榴皮多酚提取物及纯化物对α-葡萄糖苷酶的抑制作用研究

张海均，贾冬英，孙 慧，姚 开

四川大学轻纺与食品学院，成都610065

α-葡萄糖苷酶是小肠绒毛上皮细胞刷状缘膜上存在的寡糖水解酶，可催化α-1，4糖苷键水解，因此抑制α-葡萄糖苷酶的活性就能减缓葡萄糖的生成及吸收，降低餐后血糖峰值，减少高血糖对胰腺的刺激，提高胰岛素敏感性，从而预防糖尿病及其并发症［1］。α-葡萄糖苷酶抑制剂是一类口服降血糖药物，它能够与小肠中α-葡萄糖苷酶的活性部位结合，抑制酶的催化作用，阻止可消化低聚糖水解为单糖，使单糖的吸收时间延后，抑制餐后血糖水平的快速升高。

大量研究显示，一些多酚类、黄酮类、多糖类、生物碱类等天然产物均能抑制α-葡萄糖苷酶的活性［2-5］。有关多酚类抑制该酶活性的研究主要集中在茶多酚上，而有关石榴皮多酚对α-葡萄糖苷酶的抑制作用却鲜见报道。在本论文中作者研究了石榴皮多酚提取物及纯化物对α-葡萄糖苷酶的抑制作用及其抑制类型，期望为石榴皮多酚的精细化利用提供重要参考数据。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

石榴皮粉由新鲜石榴皮晒干后粉碎、过20目筛而成;茶多酚，(80%，w/w)为四川省筠连县茶多酚厂的产品。α-葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.20)和pNPG (4-硝基酚-α-D-吡喃葡萄糖苷)购自美国Sigma公司;石油醚、丙酮、乙酸乙酯、没食子酸、K2HPO4、KH2PO4、Na2CO3等均为国产分析纯试剂。

UV2000紫外可见分光光度计，尤尼柯(上海)仪器有限公司;DZF6030A真空干燥箱，上海一恒科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 石榴皮多酚提取物与纯化物的制备

称取一定量的石榴皮粉，加入其质量3～5倍体积的石油醚脱脂，烘干后，用其质量8～10倍的70%(v/v)丙酮溶液振荡提取3次，每次1 h，合并滤液于40℃下真空浓缩，60℃下真空干燥，得到石榴皮多酚提取物。取一定体积的浓度为75 mg/mL石榴皮多酚提取物溶液，加入等体积的乙酸乙酯，充分振荡后室温静置30 min，萃取2次，收集萃取相，将其进行真空浓缩干燥后得到石榴皮多酚的初步纯化物P-1。将处理好的D141大孔树脂按常规湿法装入玻璃柱(Ф 30 mm ×650 mm)，待树脂完全沉降后用蒸馏水洗至平衡。取浓度为100 mg/mL的P-1溶液10 mL，缓慢上样，先用300 mL蒸馏水洗脱，再用乙醇溶液进行梯度洗脱(10% ～100%，v/ v)，洗脱速度为10 mL/min，等份收集洗脱液(50 mL/份)。将收集液真空浓缩至5 mL后用硅胶板G进行TLC检测，合并斑点相同的洗脱级份，将其进行真空浓缩干燥后得到纯化物P-2。

1.2.2 石榴皮多酚提取物与纯化物的总酚含量测定

以没食子酸(GA)为对照品，参考R.P.Singh等采用的Folin-酚法［6］对石榴皮多酚提取物及纯化物中的总酚含量进行测定，以GA当量表示样品的总酚含量。GA标准曲线:Y=0.66321X+0.00404，R2=0.9996，其中X为GA质量浓度(μg/mL)，Y为吸光值。

1.2.3 α-葡萄糖苷酶活力测定

参照沈忠明等［7］和 Angelika Schäfer［8］等的方法并稍作改动。以0.1 mol/L磷酸钾缓冲液(pH 6.9)为溶剂分别配制1.0 U/mL α-葡萄糖苷酶溶液和1.0 mmol/L底物pNPG溶液。将1.0 U/mL α-葡萄糖苷酶600 μL与蒸馏水600 μL混匀后于37℃水浴中保持10 min，然后加入1.0 mmol/L pNPG 200 μL启动反应，混匀后于37℃下反应30 min，再加入0.5 mol/L Na2CO31.0 mL终止反应，混匀后稀释反应液，在400 nm处测定在酶的作用下底物释放出的硝基酚量。α-葡萄糖苷酶活力单位定义为:pH 6.9、 37℃条件下每分钟释放1.0 μmol硝基酚为1个活力单位。

1.2.4 石榴皮多酚提取物及纯化物对α-葡萄糖苷酶抑制作用的测定

参照Angelika［8］的方法并稍作改动。取1.0 U/ mL α-葡萄糖苷酶600 μL和不同浓度的待测样品200 μL，按1.2.3中方法测定多酚样品对α-葡萄糖苷酶的抑制作用。空白对照为蒸馏水，阳性对照为茶多酚。平行测定3次，取平均值。按下式计算多酚样品对α-葡萄糖苷酶的抑制率:

式中A1和A2分别为空白对照和多酚样品溶液的吸光值。

以样品浓度为横坐标，抑制率为纵坐标，绘制抑制曲线，由该曲线计算各多酚样品对α-葡萄糖苷酶的半数抑制浓度(IC50)。

1.2.5 石榴皮多酚对α-葡萄糖苷酶抑制类型的测定

选取抑制作用较强的石榴皮多酚纯化物，测定其抑制α-葡萄糖苷酶活性的类型。酶反应总体积1.0 mL，包括1.0 U/mg酶液600 μL、0.1 mol/L磷酸钾缓冲液(pH 6.9)200 μL以及不同浓度的石榴皮多酚纯化物200 μL。然后分别加入1.0 mmol/L pNPG 0.2、0.1、0.067、0.05、0.04 mL，混匀后于37℃保持30 min，加入0.5 mol/L Na2CO31.0 mL。以底物浓度的倒数1/［S］为横坐标，反应速度的倒数1/V为纵坐标作图，绘制石榴皮多酚纯化物对α-葡萄糖苷酶抑制作用的双倒数图，然后根据双倒数方程计算其抑制常数Ki。

2 结果与讨论

2.1 石榴皮多酚提取物及纯化物的总酚含量

经测定，石榴皮多酚提取物以及纯化物P-1和P-2中的多酚含量分别为总酚含量27.28、46.34和74.09 g/100 g。经纯化后样品的总酚含量均有明显提高。

2.2 石榴皮多酚提取物及纯化物对α-葡萄糖苷酶的抑制作用

不同浓度的石榴皮多酚提取物和纯化物对α-葡萄糖苷酶的抑制作用见图1和图2。可以看出，石榴皮多酚提取物和纯化物对α-葡萄糖苷酶均有较强的抑制作用，随着浓度的增加，它们对α-葡萄糖苷酶的抑制作用均逐渐增强，尤其是纯化物P-2对该酶的抑制作用与其浓度之间呈现明显的剂量效应关系。

表1是将图1和图2中数据进行线性回归后得到的石榴皮多酚提取物和纯化物对α-葡萄糖苷酶的半数抑制浓度(IC50)。IC50可表征多酚样品对α-葡萄糖苷酶的抑制作用强弱，IC50越小，说明抑制作用越强。结合图1和表1，可知3种多酚样品中，纯化物P-2对α-葡萄糖苷酶的抑制活性最大，纯化物P-1次之，石榴皮多酚提取物的抑制作用最小。3种多酚样品对α-葡萄糖苷酶的抑制作用大小与其总酚含量一致，说明样品中含有的酚类物质是其产生抑制作用的主要成分。因此，纯化有利于提高石榴皮多酚样品对α-葡萄糖苷酶的抑制作用。此外，两种石榴皮多酚纯化物对α-葡萄糖苷酶的抑制作用均高于茶多酚，但石榴皮多酚提取物对该酶的抑制作用低于茶多酚。

尹学哲等［9］研究表明，绿茶提取物抑制α-葡萄糖苷酶的IC50为0.13 mg/mL;林玉桓等［10］研究了34种中药水提物对α-葡萄糖苷酶的抑制作用，结果显示虎杖水提物抑制该酶的IC50为27.5 mg/mL。石榴皮多酚纯化物P-2抑制α-葡萄糖苷酶的IC50明显低于上述多酚样品和茶多酚，说明该纯化物对α-葡萄糖苷酶具有很强的抑制作用。

表1 石榴皮多酚样品对 α-葡萄糖苷酶半数抑制浓度(IC50)Table 1 IC50values of pomegranate peel polyphenol extract and its purified fractions on α-glucosidase

2.3 石榴皮多酚纯化物对α-葡萄糖苷酶的抑制作用类型

以抑酶活性最强的石榴皮多酚纯化物P-2为抑制剂，测定了其在浓度分别为0.01 mg/mL和0.02 mg/mL时对α-葡萄糖苷酶的抑制作用类型。以底物浓度的倒数1/［S］为横坐标，反应速度的倒数1/ V为纵坐标，绘制石榴皮多酚纯化物对α-葡萄糖苷酶抑制的双倒数图(见图3)。可以看出，随着石榴皮多酚纯化物浓度的增大，其对α-葡萄糖苷酶抑制作用逐渐增强，因此它对该酶的抑制作用为反竞争性抑制。当浓度为0.01 mg/mL时，该纯化物对α-葡萄糖苷酶抑制常数Ki为1.22 μg/mL。

图3 石榴皮多酚纯化物抑制α-葡萄糖苷酶的作用类型Fig.3 Inhibition type of purified polyphenols from pomegranate peel extract on α-glucosidase

林玉桓等［10］和刘杰超等［11］研究显示，虎杖水提物和苹果多酚提取物对α-葡萄糖苷酶的抑制作用属于非竞争性抑制。康文艺等［12］发现牛耳岩白菜正丁醇提取物对α-葡萄糖苷酶抑制作用为竞争性抑制类型。尚禹东等［13］研究显示，银杏叶醇提取物对α-葡萄糖苷酶有明显的抑制效果，其作用机制为反竞争性抑制。这些结果表明，酚类提取物对α-葡萄糖苷酶的抑制作用类型包括非竞争性抑制、竞争性抑制和反竞争性抑制。不同酚类提取物对α-葡萄糖苷酶的抑制作用类型有所不同，这可能与其主要抑酶活性成分的组成与结构以及与酶活性中心的结合部位和结合方式等的不同有关。

3 结论

石榴皮多酚提取物及纯化物均能有效抑制α-葡萄糖苷酶的活性，该抑制作用与其浓度之间存在剂量-效应关系。随着石榴皮提取物与纯化物浓度的增大，它们对该酶的抑制作用增强。石榴皮多酚纯化物较其提取物和茶多酚具有更强的抑制作用。石榴皮多酚纯化物对α-葡萄糖苷酶抑制作用类型为反竞争性抑制。有关石榴皮多酚纯化物中对α-葡萄糖苷酶产生抑制作用主要单体组分的分离、纯化、结构表征及其作用机理仍有待于进一步研究。

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