阿勒泰黄芪提取物对蛋白酪氨酸磷酸酯酶1B的抑制作用

2012-12-22 09:23赵海清杨春燕阿吉艾克拜尔艾萨
天然产物研究与开发 2012年8期
关键词:阿勒泰作图皂苷

赵海清,窦 君,杨春燕,阿吉艾克拜尔·艾萨

中国科学院新疆理化技术研究所植物资源化学重点实验室,乌鲁木齐830011

随着环境因素和行为模式的改变,糖尿病已经成为我国主要公共健康问题。2型糖尿病主要特征是胰岛素抵抗。蛋白酪氨酸磷酸酶1B(protein tyrosine phosphatase1B,PTP1B)是PTPase家族成员之一,被认为是胰岛素和瘦素信号转导通路的负调节因子,对2型糖尿病和肥胖症的发生、发展有重要的负调控作用,近年来成为治疗2型糖尿病等胰岛素抵抗相关疾病的新靶点[1-3]。在啮齿类动物和具有胰岛素抵抗肥胖人群的脂肪及骨骼肌细胞中的蛋白表达和酶活性均处于较高水平,揭示PTP1B可能在胰岛素抵抗的病理过程中具有重要的生理功能[4,5]。抑制PTP1B活性,可导致脂肪、肝脏和肌肉组织中胰岛素受体和胰岛素受体底物蛋白的磷酸化水平增强,提高下游通路中信号分子以及最终糖原合成,从而增强胰岛素信号通路转导,提高胰岛素敏感性。因此,有效的PTP1B抑制剂可能成为一类新型的胰岛素增敏剂应用于2型糖尿病和肥胖症的治疗。

黄芪属豆科植物,药用植物资源非常丰富,其中蒙古黄芪是常用的补气固表中药,临床上广泛应用于心、脑血管疾病以及糖尿病的辅助治疗及抗肿瘤、保肝。相关的化学成分研究主要集中于蒙古黄芪、膜荚黄芪[6],从中分离鉴定的山奈酚、槲皮素、异鼠李素、鼠李柠檬素、熊竹素等黄酮类化合及黄芪皂苷、大豆皂苷等皂苷类化合物,表现出丰富的化学多样性。阿勒泰黄芪(Astragalus altaicus Bge)是维药常用药材,具有补气固表、托疮生肌、治体虚自汗、利尿消肿等功效,相关研究较少。程杰飞等[7]对阿尔泰黄芪的化学成分进行了研究,但没有涉及其药理作用。本研究应用本室所建立的PTP1B体外筛选模型,对阿勒泰黄芪提取物进行活性测定,初步证明其具有较强的PTP1B抑制活性,为进一步开发该药用植物资源提供前期研究基础。

1 材料与方法

1.1 仪器与材料

实验所用PTP1B为本实验室克隆表达、提取纯化。pNPP(对-硝基苯磷酸二钠)为Sigma产品,IPTG、卡那霉素、Hepes为Merck产品,DMEM培养基、胎牛血清为Invitrogen公司产品,葡萄糖测定试剂盒为北京普利莱基因技术有限公司产品,超声波细胞粉碎机JY92-ⅡD(宁波新芝生物科技股份有限公司),高速冷冻离心机(Beckman,美国),酶标仪(SpectraMax M5,美国),其余试剂为国产分析纯。CHO-K1(仓鼠卵巢细胞亚株)细胞购自中国科学院上海细胞库。黄芪采自新疆阿勒泰地区布尔津县,并由中国科学院新疆生态与地理研究所植物专家沈冠冕鉴定。

1.2 阿勒泰黄芪提取物制备

阿勒泰黄芪经粉碎后,用甲醇提取,再用氯仿萃取,经过大孔树脂,用乙醇洗脱,浓缩干燥备用。

1.3 阿勒泰黄芪提取物黄酮、皂苷含量测定

参考《保健食品功效成分检测方法》[8],测定提取物中黄酮、皂苷含量。

1.4 蛋白酪氨酸磷酸酯酶PTP-1B的纯化及活性测定

将含pET-30a-PTP1B1-321的大肠杆菌BL21进行培养,经0.4 mmol/LIPTG诱导3.5-4.0 h,6000 r/ min离心6 min,收集菌体,冰浴超声破碎,4℃,12000 rpm离心10 min,取上清上Ni2+亲和层析柱,充分结合,用50和100 mmol/L的咪唑洗脱,4℃过夜轻微搅拌透析,再浓缩后备用。用微量法测定所获重组PTP1B的活性。测定反应体系:5 mmol/L pNPP,0.09 μmol/L his-PTP1B1-321,缓冲液(包括20 mmol/L HEPES,150 mmol/LNaCl和1 mmol/L EDTA(pH 7.0)),总体积为200 μL。室温孵育 10 min,再加入pNPP,室温孵育30 min后,用3 mol/L NaOH终止反应。在405 nm处测定吸收值,以不含酶溶液体系为空白。

1.5 提取物对PTP1B活性抑制作用的测定

1.5.1 IC50值的确定

按上述活性测定方法,提取物用DMSO溶解,按不同剂量加入,405 nm处测定吸收值,每个实验重复 3次。按抑制率 =(OD405空白-OD405样品)/ OD405空白×100%,求得不同浓度的抑制率。应用Origin软件计算IC50值。

1.5.2 抑制类型的确定

调整底物浓度,测定反应的速度,取均值利用双倒数作图法(Lineweaver-Burk plots)确定抑制类型。

1.6 葡萄糖含量的测定

培养CHO细胞24 h后,按50 μg/mL的浓度分别添加不同的提取物,作用24 h后,收集培养液,依试剂盒操作说明测定葡萄糖含量。

1.7 数据处理

采用双倒数作图法确定抑制剂对酶促反应的抑制类型。在此基础上,根据抑制类型的不同,应用不同的作图求Ki值,即(1)非竞争性抑制,则用Dixon作图法(以抑制剂的浓度对反应速度的倒数作图)求Ki;(2)反竞争性抑制,Cornish-Bowden作图法(以抑制剂浓度对反应速度的倒数作图)求Ki;(3)混合型抑制有两个抑制常数Ki,Ki',所以用Dixon作图法求Ki,同时用Cornish-Bowden作图法求得抑制常数Ki'。

2 结果

2.1 黄芪提取物中黄酮、皂苷含量

8种提取物(E1~8)中黄酮含量分别为5.09、10.46、3.58、3.23、53.91、21.77、5.76和7.49 mg/ mL,E1、E2、E6、E7和E8皂苷含量分别为16.53、27.45、21.9、10.21和8.96 mg/mL,其余提取物中未检测到皂苷。

2.2 黄芪提取物对PTP1B活性的影响

以pNPP为底物,NaVO3作为阳性对照,测定his-PTP1B1-321的活性。用DMSO溶解种不同的阿勒泰黄芪提取物(E1~8),配成不同浓度,按上述方法检测其对PTP1B抑制作用。结果显示,E3、E4、E5和E6对PTP1B的作用不明显;E1、E2、E7、E8对PTP1B具有较强的抑制活性,IC50分别为34.8、4.7、7.35和7.15 μg/mL。

2.3 黄芪提取物对PTP1B抑制作用的动力学分析

4种有活性提取物对his-PTP1B1-321抑制动力学进行研究。结果表明,与空白对照组相比较,阿勒泰黄芪提取物1、7和8可使表观Km值增大,但不影响PTP1B的Vmax,双倒数作图后,与空白对照组的直线相交于纵轴,提示其对PTP1B的抑制作用类型属于竞争性(图1、图3和图4)。阿勒泰黄芪提取物2在双倒数作图时,直线的交点并不交在1/[S]轴或1/v轴上,而是相交于第II象限,表现出混合型抑制;应用Dixon作图法,求出E2的Ki为0.177,另外,采用Cornish-Bowden作图法求另一抑制常数Ki'为0.134,表现出Ki>Ki',提示其抑制作用类型为混合型中的竞争性抑制(图2)。

图1 阿勒泰黄芪提取物1对PTP1B抑制作用类型测定Fig.1 Determination of the inhibitory mode of extract 1 of A.altaicuson PTP1B

2.4 对葡萄糖利用的影响

在相同的浓度下,不同的提取物对CHO细胞利用葡萄糖的能力不同。提取物1、2、5、7和8较明显提高CHO细胞对葡萄糖的利用。提取物3、4和6对CHO细胞利用葡萄糖的能力影响不明显。

阿勒泰黄芪提取物对CHO细胞利用葡萄糖的影响Fig.5 Effect of extracts of A.altaicuson the rate of glucose in CHO cells

3 讨论

由于2型糖尿病的发生与β产生胰岛素、血液循环系统运送胰岛素以及胰岛素作用靶细胞并发挥生理作用密切相关,与之相关的酶靶,就成了2型糖尿病药物开发的靶标[9],同时已成为降低糖尿病发病率的重要防治策略。目前蛋白酪氨酸磷酸酶作为负性调节胰岛素信号转导的关键酶,对糖尿病的发生、发展有着重要的意义。PTP1B的活性和/或表达过度升高,可下调胰岛素信号转导,抑制葡萄糖的摄取和糖原合成,导致胰岛素抵抗和糖尿病状态。

从天然植物,特别是具有药用背景的植物中分离PTP1B抑制剂是目前研究的热点[10]。维医药在2型糖尿病治疗方面具有较好的效果,已针对不同的靶点(如醛糖还原酶,α-葡萄糖苷酶等),筛选出许多相关的天然抑制剂[11,12]。本研究比较维药阿勒泰黄芪不同提取物的PTP1B抑制活性,发现4种组分对PTP1B有好的抑制作用,具有不同的抑制类型。通过细胞实验,初步证实活性组分能有效提高细胞对葡萄糖的利用度。但是,PTP1B抑制活性的强弱与对葡萄糖利用度的影响不成正相关,提示阿勒泰黄芪除了通过PTP1B途径降糖外,可能还存在其它的降糖方式。

黄酮类化合物的药理活性有大量报道,已证实具有降糖、降脂、改善胰岛素抵抗的作用。为此,我们研究了黄酮、皂苷的含量与PTP1B抑制活性的关系,初步推测阿勒泰黄芪中皂苷可能是主要的活性物质,将为后续的活性化合物的分离提供指导。本研究结果将为我们以活性跟踪法从植物药中筛选靶向性强、高效低毒的天然抑制剂提供了新的思路,并为开发为防治糖尿病及改善胰岛素抵抗的药物或保健品提供了实验依据。

1 Zhang ZY.Protein tyrosine phosphatases:structure and function,substrate specificity,and inhibitor development.Annu Rev Pharmacol Toxicol,2002,42:209-234.

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3 Ramachandran C,Kennedy BP.Protein tyrosine phosphatase1B:a novel target for type 2 diabetes and obesity.Curr Top Med Chem,2003,3:749-757.

4 Ahmad F,Azevedo JL,Cortright R,et al.Alteration in skeletalmuscleprotein-tyrosinephosphataseactivityand expressionininsulin-resistanthumanobesityanddiabetes.J Clin Invest,1997,100:449-458.

5 Ahmad F,Considine RV,Bauer TL,et al.Improved sensitivitytoinsulininobesesubjectsfollowingweightlossis accompanied by reduced protein-tyrosine phosphatases in adiposetissue.Metabolism,1997,46:1140-1145.

6 Su YL(苏彦雷).Research progress on Astragali mongholicus.J Strait Pharm(海峡药学),2009,12:1-4.

7 Cheng JF(程杰飞),Wu JF(吴剑飞),Aziguli(阿兹古丽),et al.Study on chemical constituents from the Astragalus altaicus.Chin Tradit Herb Drugs(中草药),1994,25:563-564.

8 Wang GY(王光亚).The detection method of functional component in health food(保健食品功效成分检测方法).Beijing:Chinese light industry press,2002:133.

9 Yang W,Lu J,Weng J,et al.Prevalence of diabetes among men and women in China.N Engl J Med,2010,362:1090-1101.

10 Cui L,Ndinteh DT,Na M,et al.Isoprenylated flavonoids from the stem bark of Erythrina abyssinica.J Nat Prod,2007,70: 1039-1042.

11 Aihemait W(吾布力哈斯木·艾合买提),Shademhanmd D (迪利夏提·沙德穆罕默德).Clinical observation on 172 cases suffered from diabetes mellitus treated by Uigurian medicine.J Med Pharm Chin Minor(中国民族医药杂志),2000,6:8-9.

12 Wang YQ(王玉芹),Chen N(陈娜),Aisa HA(阿吉艾克拜尔·艾萨),et al.Effect of reducing plasmas glucose of active fractions and chickpea of Uygur medicine.Chin Tradit Patent Med(中成药),2007,29:1832-1834.

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