氯化锂、紫外线对金色链霉菌(Streptomyces aureofaciens)产金霉素特性的诱变作用

王鹏飞，谢昌贤，刘运添，李兰枝，郝新乐，陈有君

(1.内蒙古大学生命科学学院，内蒙古呼和浩特010021;2.金河生物科技股份有限公司，内蒙古呼和浩特010200;3.内蒙古农业大学生命科学学院，内蒙古呼和浩特010018)

金霉素是一种四环类抗生素，生产上从金色链霉菌的代谢产物中分离得到。目前生产用菌株产金霉素的效价较低，是影响生产效益的重要因素。金色链霉菌产生四环类抗生素及其衍生物的特征受其遗传基因控制，如果通过改变其遗传特性，提高生产效能将会带来很好的经济与社会效益。变异性普遍存在，遗传因子发生改变，产生可以遗传的新的性状［1］。Stryzhkova HM等［2］用紫外线与nitrosoguanidine复合处理金色链霉菌获得抗菌活性高出30%～35%的突变株。袁琳［3］用氯化锂与紫外线复合处理金色链霉菌获得活性提高12.3%～37%的四环素产生菌变株。陈梁军［4］用60Co-γ射线照射(剂量为30Gy)处理金色链霉菌(Streptomcesaureofaciens)得到1株去甲金霉素突变株，其摇瓶效价较出发菌株提高32%。陈红等［5］用微波处理金色链霉菌得突变菌株产四环类抗生素的效价高于对照10.5%左右。陈梁军［6］经紫外线(25 317 nm、30 W、距离20 cm、60 s)照射、金霉素耐受等处理金色链霉菌，得到1株金霉素突变株，其摇瓶效价较出发菌株提高18%。紫外线能引起DNA的改变而导致变异，氯化锂单独处理无效［7］，但与紫外线复合处理后，可以提高诱变效率。因而通过氯化锂、紫外线复合处理，研究了金色链霉菌产金霉素特性的诱变特性。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 出发菌株金色链霉菌，菌株34-55#。

1.1.2 培养基①平板培养基(质量分数%，120℃灭菌30 min。下同):小麦面粉2.0，酵母0.1，硫酸镁0.005，磷酸二氢钾0.01，磷酸氢二铵0.015，琼脂2.0;②斜面培养基:麸皮3.2，硫酸镁0.005，磷酸二氢钾0.01，磷酸氢二铵0.015，琼脂2.0，pH 7.4～7.6;③种子培养基:玉米淀粉4.0，黄豆饼粉2.0，蛋白粉0.5，酵母粉0.5，碳酸钙0.4，硫酸铵0.3，氯化钠0.2，硫酸镁0.025，磷酸二氢钾0.025，培养基装量25 mL/250 mL三角瓶;④发酵培养基:玉米淀粉10，花生饼粉1.5，黄豆饼粉2.5，淀粉酶0.004，氯化钠0.25，硫酸铵0.5，碳酸钙0.7，蛋白粉1.4，酵母粉0.2，硫酸镁0.025，豆油1.25 mL/25 mL，培养基装量30 mL/250 mL三角瓶。

1.2 方法

1.2.1 发酵效价测定化学测定法:金霉素在酸性溶液中经加热后能脱去一分子水，生成黄色的脱水金霉素，其色度与含量成正比。故利用比色法来测定其效价。发酵液经草酸酸化过滤后，吸1 mL滤液于9 mL蒸馏水中，分别吸取1 mL稀释滤液于2只50 mL装有5 mL 2 mol/L盐酸的容量瓶中，一只用作CK，另一只于沸水煮沸5 min，冷却后加水定容至刻度，摇匀后于722N型分光光度计、波长440 nm、光程1 cm测定。

1.2.2 菌种复合处理及筛选①诱变处理:将培养好的金色链霉菌34～55#菌株的新鲜斜面加入20 mL无菌水，用刮棒将成熟孢子轻轻刮下，将制得的孢子悬浮液倒入带有玻璃珠的三角瓶中振摇15 min。振摇结束后双层滤纸过滤，制成单孢子悬浮液。取单孢子悬浮液稀释100倍后，于培养皿中(每皿加5 mL)，置波长2 357×10-10m，功率20 W的紫外灯下，40 cm处，在磁力搅拌器搅拌下照射10～60 s。将处理好的孢子液，稀释104倍左右(因孢子浓度不同稀释103～106倍)，涂布在分离平板上，在温度35±0.5℃、相对湿度40%～60%条件下培养2～3 d，计算诱变死亡率;②平板分离:将处理好的孢子液，稀释104倍左右，涂布在含有0.5%氯化锂的分离平板上，在温度(35±0.5)℃、相对湿度40%～60%条件下培养4～5 d，用接种针随机挑取各种形状的菌落孢子接到试管斜面上培养，将其在温度(35±0.5)℃、相对湿度40%～60%条件下培养4 d后即得突变菌落;③初筛:将成熟后，生长好的带孢子斜面挖块0.5 cm×0.5 cm接入种子瓶中，在温度(30±0.5)℃、ZP-96型摇瓶机、240 r/min条件下培养24 h后，将长好的种子液按10%接种量接入发酵瓶中，在温度(30±0.5)℃、ZP-96型摇瓶机、240 r/min条件下培养5 d后测定其效价。选效价高出CK 10%的菌株进行保藏及传代;④稳定性实验:斜面传5代，主要考察斜面孢子的外观及生产能力的稳定性，经过摇瓶测定，选取外观稳定、摇瓶效价稳定的菌株进行复筛。培养条件:温度(35±0.5)℃、相对湿度40%～60%条件下培养4 d;⑤复筛:将挑选好的菌株接斜面，然后上摇瓶复筛，做3批，每批3个平行样，5 d后测定其效价，选取效价高的菌株自然分离后到发酵车间进行试生产。

2 结果与分析

2.1 紫外线致死情况

表1是不同时间处理金色链霉菌孢子的致死情况，从中可以看出本试验条件下处理10 s，致死率就达到了接近90%，而处理1 min左右，几乎全部杀死。

2.2 突变情况

表2说明金色链霉菌经氯化锂、紫外线复合处理后，正突变与负突变都有，但正突变的比率略高于负突变。但效价高于对照10%以上的正突变略低，只有11.4%。效价低于10%的负突变占15.8。

2.3 高效价菌株筛选

从初筛效价高于对照10%以上的菌株中选出13株进行稳定性传代，传了5代，选出5株斜面生长较好且效价较高的菌株进行复筛，结果见表3，可见，19#、20#、111#3株相对效价提高率低于10%，44#、103#均高出对照10%以上。

表1 不同处理时长的死亡率Table 1 Lethal percentage of different treatments

菌株55-44#的特征:菌株55-44#经斜面培养后，气生菌丝较55#丰富，且背部色素分泌多，孢子较为饱满、整齐，用群体传代的方法考察了斜面传代的稳定性，传至5代，生产能力稳定。

表2 菌株效价突变分布Table 2 The distribution of titer of mutant bacteria

表3 突变菌株初筛、传代稳定性及复筛摇瓶效价比较(r/mL)Table 3 The comparison of titer of different mutants in selection

2.4 菌株44-3#的生产能力验证

表4 44-3#菌株与生产CK的比较(r/ml)Table 4 Comparison between 44-3#and its original bacterium

由菌株55-44#自然分离后得到的菌株44-3#与出发菌株55#培养成熟的斜面孢子分别经种子培养基移种到发酵培养基摇瓶培养，44-3#摇瓶效价比对照高13.1%。因此将其拿到发酵车间上罐进行试生产，共上60 t发酵罐15批，生产能力较出发菌株提高4%以上(表4)，差异达极显著水平(P＜0.002)。

3 讨论

本实验应用紫外线、氯化锂对金色链霉菌进行诱变，得到2株大而饱满、鼠灰色、草帽型的菌株，命名为55-44#、55-103#，其中55-44#经自然分离得到的44-3#菌株摇瓶效价较对照高13.1%。和生产CK相比，生产水平显著高于CK 4.05%。该菌株后经大面积使用，有明显的增产效果。

［1］ 施巧琴，吴松刚.工业微生物育种学［M］.北京:科学出版社，2009，03.

［2］ Stryzhkova HM，Kopeǐko OP，Lavrinchuk VIa，et al.Spontaneous and induced variability of Streptomyces aureofaciens-chlortetracycline producer［J］.Mikrobiol Z，2002，64(4):19-23.

［3］ 袁琳.采用氯化锂和紫外线复合诱变方法筛选四环素高产菌株［J］.宁夏医学杂志，2000，22(6):340-341.

［4］ 陈梁军.去甲金霉素高产菌的选育及发酵培养基的优化［J］.海峡药学，2010，22(9):203-204.

［5］ 陈红，王春魁，郭娜，等.微波诱变法选育四环类抗生素菌种的探索和应用［J］.中国抗生素杂志，2008，33(11):2-3.

［6］ 陈梁军.金霉素发酵工艺研究［J］.海峡药学，2010，22(6):23-25.

［7］ 徐亲民.抗生素工艺学［M］.北京:中国建材工业出版社，1994，8.