猪流行性腹泻病毒检测方法研究进展

庄金秋，梅建国，王金良，沈志强* ，丁 壮

(1．山东省滨州畜牧兽医研究院，中国山东滨州 256600;2．吉林大学畜牧兽医学院，中国吉林长春 130062)

猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea，PED)是由冠状病毒科冠状病毒属的猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)引起的一种猪的高度接触性肠道传染病，以水样腹泻、呕吐、脱水和食欲下降为主要特征。本病有一定的季节性，多发生于冬季12月至次年2月寒冬季节，但在夏季也可发生。PED在各年龄的猪均可感染，传播迅速，年龄越小，发病率和病死率越高，给养猪生产造成巨大的经济损失。PEDV于1977年由比利时的Pensaert首先发现，并从病料中分离出一株不同于猪传染性胃肠炎病毒(transmissible gastroenteritis virus of swine，TGEV)的病毒，将其命名为类冠状病毒(CVL)CV777株。随后英国、匈牙利、西德、加拿大、日本等国相继报道有该病的发生。1982年国际病毒分类委员会将该病毒归类为冠状病毒属。我国于1980年首次分离到PEDV。近年来，PED的流行区域有不断扩大的趋势，成为严重危害养猪业的传染病之一［1－3］。PEDV与TGEV同属冠状病毒属成员，二者在病毒粒子形态、临床症状及流行病学方面极为相似，难以区分。对于PED的确诊，有赖于实验室检测。本文就PEDV的实验室检测方法研究进展作一综述，以为PED的确诊提供参考。

1 病毒分离鉴定

1．1 病毒的细胞培养 与其他冠状病毒相比，PEDV的细胞培养相对比较困难，从PEDV发现开始，很多研究人员尝试用不同的方法将PEDV适应于细胞，但用了近10年的时间都没有取得成功，这在一定程度上制约了PEDV研究进程。直到1988年，Hofmann M等［4］首次在培养基含胰酶的 Vero细胞上成功繁殖出PEDV，并认为胰酶对PEDV纤突糖蛋白切割作用增强了病毒对Vero细胞的感染力，此方法在PEDV分离、细胞培养和疫苗的研究中被广泛应用;此后，Kusanagi K 等［5］(1992)对PEDV细胞培养进行了深入研究，相继在仔猪膀胱、肾脏的原代细胞和 KSEK6、IBRS2、MA104、CPK、ESK的传代细胞系上成功培养了PEDV。我国李树根等［6］(1993)已有PEDV在Vero细胞上培养成功的报道。李品齐等［7］(1997)用含有60μg/mL胰酶液的Vero细胞培养液中进行PEDV传代适应，在第3代就出现明显的 CPE，第5代毒价可达10－7．0/0．1mL，并通过乳猪回归试验和特异性中和试验证实所增殖的病毒为猪流行性腹泻病毒。修金生等［8］(2012)所在研究室参考国内外文献，将胰酶浓度控制在6μg/mL连续传5代而获得病毒。

PEDV的体外细胞培养难度大，繁殖条件复杂，病毒在细胞培养中繁殖滴度低，细胞病变产生不明显，一直是PEDV体外增殖过程的一个重要技术瓶颈，直接影响了对该病毒生物学特性基础研究和实践中该病毒相关生物制品的发展。PEDV在细胞上的成功培养对其研究具有重要意义，解决了PEDV研究的瓶颈问题，为PEDV理化特性、疫苗及其相关分子生物学的研究奠定了物质基础，使PEDV的研究进入了一个新阶段。

1．2 免疫电镜法(IEM) 一般来说，电镜法可以有效的作出病原的诊断，可以通过电镜来观察病毒的结构、形态特征及立体构型等特点。如将感染猪小肠或病毒细胞培养物制成超薄切片在电镜下观察，则可从平面上观察到病毒的内部结构，形态大小，复制方式等。由于PEDV与TGEV同属冠状病毒，形状非常相似，在普通电镜下无法区别，为此需用免疫电镜法(IEM)。IEM法既可用已知的PEDV高免血清检测未知抗原，又可用已知的PEDV抗原检测未知抗体。如可疑病料中含有PEDV病毒粒子，由于抗原和抗体的特异性结合，病毒粒子呈晶格状排列，并可见到毒粒间的抗体桥。王继科等［9］(1991)把PEDV的抗原和抗体分别经10000 r/min离心、免疫复合物又经12000 r/min离心后，通过电镜观察到了典型的病毒粒子形成的免疫复合物，并建立了具有3次筛选作用改良的IEM法。该方法简便、直观、快速、定性准确，但该方法要求有价格高昂的电镜设备，而且电镜检查一般需3～7 d才能出报告，不适用于大规模临床诊断。

2 血清学检测

2．1 微量血清中和试验(NT) 林志雄等［10］(1994)利用已适应于传代细胞生长的PEDV－G1株，以PK－15作指示细胞，与被检血清进行微量中和，测定待检血清中的特异性抗体，48h进行结果判定，证实该方法可以用来检测PEDV，而且检测结果准确、可靠，具有较高的敏感性，可用于大规模的流行病学调查。但该方法需要标准毒株作为指示毒株和成熟的细胞培养体系，实验条件的限制因素比较多，很难在短期内应用于临床实践。

2．2 免疫荧光法(IF) 免疫荧光(IF)一般分为直接免疫荧光(FAT)、间接免疫荧光(IFAT)和免疫过氧化物酶技术，3种方法都可应用于实验室诊断。若IF或免疫过氧化物酶试验呈阳性，并伴有腹泻症状，则几乎肯定为PEDV。试验研究证明，FAT检测病料中的PEDV抗原是一种比较可靠的特异性诊断方法，目前应用最为广泛。本方法适用于急性期内(5～7 d)患猪小肠黏膜的检查及对病毒分离物鉴定。取病猪小肠作冰冻切片或小肠黏膜抹片，风干后丙酮固定，加荧光抗体染色，充分水洗，封盖镜检，1～2 h即可得出结果。为了与TGEV鉴别，最好同时用TGEV荧光抗体染色检查。崔现兰等［11］(1990)应用FAT检查病猪小肠的冷冻切片或小肠抹片，对PEDV人工感染仔猪检出率为91．4%。朱维正等［12］(1990)用间接血凝试验与IFAT比较后认为IFAT法更敏感。林志雄等［13］(1997)用适应于 Vero、PK15等传代细胞株生长繁殖的PEDV－G1株建立了FAT法。同时，与哈尔滨兽研所的荧光抗体方法比较，阳性符合率达95%(19/20)，阴性符合率90%(9/10)。并不与TGEV、猪细小病毒(PPV)、轮状病毒和大肠杆菌等发生交叉反应。证明该方法具有较高的准确性和特异性。由于免疫荧光技术需要在病死猪只或在腹泻早期扑杀后取肠道组织制备切片，故很难用于临床诊断。

2．3 酶联免疫吸附试验(ELISA法) 用ELISA方法检测PEDV被大量应用于临床实践中，该法既可用于测定抗原，也可用于测定抗体，是国际贸易指定标准诊断方法之一。ELISA最大的优点是可从粪便中直接检查PEDV抗原，而且比电镜更敏感、可靠，目前应用较为广泛。当病猪一出现腹泻，即可进行检测，甚至痊愈不久的病猪，仍可用该方法进行检测。在国外，Oh JS等［14］(2005)建立了间接ELISA诊断方法，与病毒血清中和试验对比证明，该ELISA方法具有较高的敏感性和特异性，能用于PEDV的检测。Rodak L等［15］(2005)建立了竞争阻断ELISA诊断方法，适于PEDV流行病学调查。Hou XL等［16］(2007)建立了检测 PEDV血清的ELISA方法，为PEDV血清学监测提供手段。国内于强等［17］(1987)建立了间接ELISA法检测PED抗体的方法。朱维正［18］(1988)建立了双抗体ELISA法，从腹泻病猪粪便中直接检测病毒抗原。陈茹等［19］(1997)建立了用于检测 PEDV抗体的Dot－ELISA，并对比了该方法和琼脂扩散试验的检测情况，结果表明，Dot－ELISA更敏感，且该法重复性较好。邹勇等［20］(2000)用PEDV细胞培养物提纯的抗原，组织毒免疫获得的高免血清建立了间接ELISA检测PEDV抗体水平。田间检测结果与临床发病和预期结果一致。

2．4 免疫组化法 韩国学者Kim O等［21］(1999)建立了可在福尔马林固定、石蜡包埋的肠组织中准确而特异的检出PEDV的单克隆抗体基础上的免疫组化法，该方法也可用于鉴别诊断 PEDV与TGEV。但该方法对病料的前期处理比较繁琐。

2．5 胶体金免疫层析法(GICA) 张利勃等［22］(2011)为建立了一种高效、经济、简便适用于基层防疫检疫人员使用的PED疾病的GICA检测方法，由此制成一种检测PEDV血清抗体的快速诊断试纸。该GICA与ELISA具有相近的灵敏度，在二者检测的75份临床样本中有65份共同检测为阳性结果，7份共同检测为阴性结果，其符合率达96%。说明该GICA检测技术的建立为检测PEDV抗体提供了一种快速简便的方法。

3．3 分子生物学检测

3．3．1 原位杂交技术(ISH) 原位杂交技术(in sit hybridization，ISH)是分子生物学、组织化学及细胞学相结合而产生的一门新兴技术，始于20世纪60年代。原位杂交技术的基本原理是利用核酸分子单链之间有互补的碱基序列，将有放射性或非放射性的外源核酸(即探针)与组织、细胞或染色体上待测DNA或RNA互补配对，结合成专一的核酸杂交分子，经一定的检测手段将待测核酸在组织、细胞或染色体上的位置显示出来。为显示特定的核酸序列必须具备3个重要条件:组织、细胞或染色体的固定、具有能与特定片段互补的核苷酸序列(即探针)、有与探针结合的标记物。Kim O等［23］(2002)利用标记地高辛的核酸探针(0．1 ng/μL)加入的300μL的标准杂交缓冲液中，在加热板上95℃加热10 min后把组织切片放到冰上淬火。大约有50 ng的地高辛的核酸探针添插到标准杂交缓冲液中(50μL)。通过一系列的处理后，标记地高辛的核酸探针可以与人工感染仔猪的PEDV的核衣壳蛋白基因进行碱基互补配对，通过透射电镜下观察到仔猪的空肠和结肠的上皮细胞的胞质呈黑色。从而可以证明是PEDV感染的仔猪腹泻。该试验在79个阳性样本中检测出71个是阳性的，检出率为91%。另外，该试验还证明，原位杂交技术对于检测福尔马林溶液固定的组织样本较为敏感，其检测效果较好。

3．3．2 PCR技术 近年来，随着分子生物学的发展，对于PEDV和TGEV核酸的检测方法越来越受到人们的重视。有研究表明，RT－PCR法是目前鉴别诊断TGEV和PEDV最敏感、特异的方法。与传统方法比较，RT－PCR方法只需要病猪的粪便即可进行活体诊断，便于疾病的早期诊断，敏感性和特异性高，而且操作步骤更加快速、方便，一般4～6 h内可以提供准确的结果。Ishikawa等［24］(1997)根据S基因序列设计了一对可扩增目的片段854 bp的引物，成功的建立了检测PEDV的RT－PCR法，可进行细胞毒和粪便毒的检测。Kubota等［25］(1999)以M基因和N基因为靶基因也成功建立了可进行PEDV细胞毒和粪便毒的RTPCR检测方法。Kim O等［23］(2002)建立了 TGEV和PEDV的二联RT－PCR诊断方法，可同时检测出10TCID50/mL的TGEV和PEDV。并对免疫组化、原位杂交、RT－PCR三种方法进行了比较，认为RT－PCR法检测结果的重复性最好。但当被检样品为福尔马林固定时，采用免疫组化和原位杂交这两种方法更适合。此外，Kim O等还建立了鉴别TGEV和PEDV的多重巢式RT－PCR法。此方法适用于检测福尔马林固定的组织。Song等［26］(2006)建立了鉴别诊断PEDV、TGEV和猪轮状病毒(PORV)的多重RT－PCR(Multi－RT－PCR)，为鉴别3种病毒性腹泻病原的混合感染提供了技术支持，同时又建立了检测PEDV的实时荧光定量PCR，对仔猪体内PEDV的病毒载量进行了定量。国内，吴凌等［27］(2003)建立了用于检测PEDV的巢式RT－PCR方法。张素芳等［28］(2004)建立了嵌套式RT－PCR方法，不仅可以检测细胞培养中的PEDV，亦可以检测粪样中的PEDV，灵敏性和特异性较好。贾赟等［29］(2005)在优化RT－PCR反应条件的基础上，建立了检测PEDV的新型套式RT－PCR方法，并用该方法对PEDV进行了快速诊断和分析。陈芳等［30］(2005)、杨群等［31］(2006)、邓等［32］(2009)、赵雯雯等［33］(2010)为了检测、区分TGEV和PEDV，建立了同时检测这两种病毒的多重RT－PCR方法。用于临床TGEV和PEDV引起的猪肠道疾病的鉴别诊断。张坤等［34］(2010)建立了一种新的能够同时检测PEDV、TGEV和GAR的多重RT－PCR方法，并将这种方法和常规的RT－PCR进行了比较。多重RT－PCR检测方法能够检测到35 pg的TGEV－PEDV－GAR三联苗的混合RNA。该方法敏感性高、特异性强，是一种新的检测PEDV、TGEV和GAR的方法。随着人们对PCR技术的不断完善和创新，越来越多敏感、特异的PCR方法被应用于PEDV的检测。

3．3．3 荧光定量PCR技术 荧光定量PCR(fluorescence quantitative polymerase chain reaction，FQ －PCR)技术是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。PCR定量技术克服了传统PCR易污染、后处理步骤繁杂冗长、缺乏准确定量等缺点，具有特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快、全封闭反应等优点，在PEDV诊断方面也取得了进展。Kim SH等［35］(2007)根据Taq Man探针荧光定量分析原理建立了多重实时荧光定量PCR，为PEDV和TGEV病毒载量的检测提供了技术手段。刘邓等［36］(2010)建立了Taq Man荧光定量PCR方法。以质粒作为模板时，在40个循环内即可检测到10copies/μL的质粒DNA。比Kim O等建立的常规的RT－PCR方法敏感性至少提高了l0倍。并对TaqMan荧光定量RT－PCR法和RT－PCR法的检测结果进行了对比和分析，结果表明普通RT－PCR检测PEDV存在漏检的可能，而TaqMan荧光定量RT－PCR法具有准确、定量、污染低、灵敏度高、特异性强及省时省力等优点。王金良等［37］(2010)、修金生等［38］(2012)建立了检测 PEDV的 SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法，为该病的早期诊断并定量分析PEDV感染程度奠定了基础。该方法操作简便、重复性好，敏感性高，可实时定量分析病毒核酸在动物体内的含量，从而明确PEDV感染程度，并能为PEDV的早期诊断提供重要参考。

4 存在的问题与展望

综上所述，在PEDV的检测中，近年来研究的侧重点主要是ELISA法和PCR法，这两种方法以其实用性强、高效、快速、准确而被广泛应用。尤其是PCR检测技术，比ELISA法更加敏感，特异性也较强。尽管PCR法的敏感性和特异性都很好，但由于对仪器设备等要求很高，特别是荧光定量PCR方法对实验操作人员以及实验条件等的要求较为严格，以及检测成本的限制，因此在推广上仍有很大的限制。近年来建立起来的PEDV胶体金抗体检测试纸条方便、快速、安全，便于操作，是一种环保型的检测方法，但只能用于抗体水平的检测。在实际工作中，可根据实验室基础条件综合选用合适的检测方法。随着分子生物学的发展和人们对PEDV研究的不断深入，更多更为高效、敏感、特异、快速、简易而且价廉的检测方法将会被研究建立起来。

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