人工核酸酶用于基因组定点编辑的研究进展

张殿宝，施 萍，庞希宁*

(中国医科大学1.基础医学院干细胞与再生医学研究室;2.附属第一医院全科医学教研室，辽宁沈阳110001)

随着全基因组测序技术的进步和DNA 元件百科全书计划(encyclopedia of dna elements，ENCODE)等后基因组计划的实施［1］，将大量的数据转化为功能和临床相关的信息成为我们新的挑战。解决该问题的核心是阐明基因型对表现型的影响［2］。传统的同源重组技术失活靶基因的效率低下、耗时费力且具有回复突变的风险，RNAi 技术对靶基因失活不完全、重复性差、有脱靶效应［3］，因此亟需优秀的基因组编辑工具克服这些缺点。近年来发展起来的人工核酸酶(engineered nucleases，EN)技术为此带来了新的曙光，使研究者能够对不同物种和细胞中的几乎所有基因进行编辑［4］。本文对EN 的类型、原理、应用及存在的问题等进行综述。

1 利用EN 进行基因组定点修饰的一般原理

EN 进行基因组定点修饰主要包括2 个步骤［5］:首先，设计并构建EN，进而在靶位切断基因组DNA，形成双链断裂(double-strand break，DSB);其次，DNA 损伤激活DNA 修复通路，启动自我修复。修复通常由一种或两种途径完成:切断的DNA 末端进行易错的非同源末端连接(non-homologous end joining，NHEJ)，或利用DNA 模板进行同源重组(homologous recombination，HR)。NHEJ 修复能够产生较小的插入或缺失，使基因发生突变或完全敲除;而以引入的同源DNA 为模板进行HR 修复，能够对基因组进行定点修饰。

2 人工核酸酶的类型

目前，EN 主要包括4 类:锌指核酸酶(zinc-finger nuclease，ZFN)、类转录激活因子效应物核酸酶(transcription activator-like effector nuclease，TALEN)、CRISPR/Cas 系统(clustered regulatory interspaced short palindromic repeats/CRISPR associated systerm，CRISPR/Cas)和人工的大范围核酸酶(engineered meganuclease，EM)。

2.1 ZFN

ZFN 由DNA 结合结构域和切割结构域组成。DNA 结合域来自锌指蛋白(zinc-finger protein，ZFP)，一般包括3 ～6 个Cys2His2 锌指重复单位，每个ZFP 能够相对特异地识别靶位上的3 个连续的碱基，因此每对ZFN 能够识别18 ～36 个碱基。ZFP 由约30 个氨基酸残基组成，呈α-β-β 结构，其中α 螺旋中的－1 ～+6 氨基酸残基决定其特异性，改变这些氨基酸的组成可以设计出识别不同碱基的ZFP。ZFN 的切割结构域与结合结构域的C 端相连，目前多应用来源于海床黄杆菌(Flavobacterium okeanokoites)的Fok Ⅰ核酸酶，Fok Ⅰ能够二聚化产生核酸内切酶活性［6］。

将ZFN 的质粒或mRNA 通过转染或注射进入细胞后，核定位信号引导ZFN 进入细胞系，两个ZFN分子的Fok Ⅰ结合结构域与目标位点结合，如果DNA 双链上的这两个位点的方向和距离合适，两个Fok Ⅰ分子在间隔区形成二聚体，造成DSB，启动DNA 修复机制［7］。

ZFN 的构建包括靶位选择、ZFP 构建、Fok Ⅰ切割域的选择和优化等步骤。ZFN 的设计至关重要，除了根据已知的ZFP 结合位点直接构建ZFN 外，Joung 成立的“锌指联合会”提供在线软件ZiFiT，其中包括模块组装(modular assembly，MA)，OPEN(oligomerized pool engineering)和CoDA(context dependent assembly)方法;另外，还有Sangamo 私有的双锌指模块组装方法和Wolfe 实验室的方法等可供选择使用。

目前，ZFN 已应用于植物、动物和微生物的研究中。与传统的基因操作技术相比，技术优势明显，尤其是定点整合的突破。一般情况下，引入细胞的ZFN 为瞬时表达，对细胞毒性较小。但是，ZFN 的设计筛选耗时费力，而且可能存在脱靶效应，使其未能成为广泛应用的常规技术［8］。

2.2 TALEN

TALEN 自2010年成功应用于基因打靶，结构与ZFN 类似，其DNA 结合结构域TALE 蛋白家族来自黄单胞杆菌(Xanthomonas spp.)。该结构域由12 ～30 个重复单元串联构成，每个重复单元由33 ～35 个氨基酸残基组成，其中的第12、13 位氨基酸残基称为重复可变双残基(repeat variable di-residue，RVD)。每个RVD 负责识别1 个DNA 碱基，不同的RVD 能够特异性识别4 种碱基中的一种或多种［9］。TALE 重复单元与靶序列具有很好的对应性，编码比ZFN 简单，对提高特异性和设计人工核酸酶更有利。将设计好的TALE 与Fok Ⅰ核酸酶融合，就形成了能够识别并切割特定DNA 序列的新核酸酶TALEN。TALEN 蛋白一般在N 端有转运信号(translocation signal)，C 端有核定位信号和转录激活结构域(activation domain，AD)，中部是介导其与DNA 特异识别与结合的结构域。一对TALEN 分子与靶位结合后，Fok Ⅰ在间隔区二聚化切断 DNA 双链，形成DSB［10］。

靶位点的选择和TALEN 的组装是应用TALEN的关键。目前普遍认为，TALEN 靶位点5'端前一位的碱基应为T。为优化设计，一些实验室构建了预测设计TALEN 靶点的服务器可供使用，如TALE-NT(https://tale-nt．cac．cornell．edu)、ZiFiT (http://zifit．partners．org/ZiFiT)和idTALE(http://idtale．kaust．edu．sa)等。

TALE 重复单元的序列几乎相同，提高了串联克隆的难度。TALEN 的构建主要依靠分子克隆的手段，目前已形成了几种快速有效的方法:基于Golden Gate 分子克隆的方法，根据单体的来源不同可分为基于PCR 的Golden Gate-PCR 和传统的基于质粒载体的Golden Gate-Vector;基于连续克隆组装的方法:包括限制性酶切-连接法(restriction enzyme and ligation，REAL)、单元组装法(unit assembly，UA)和id-TALE 一步酶切次序连接法;基于固相合成的高通量方法:包括FLASH 和ICA(iterative capped assembly);基于长黏末端的LIC(ligation-independent cloning)组装方法等。

目前，TALEN 已在体外及植物、酵母、动物和人细胞中得到应用。TALEN 有潜力成为一种操作方便、特异性强、经济高效、适用范围广的基因组定点修饰技术。

2.3 CRISPR/Cas 系统

CRISPR/Cas 系统是一种基于Ⅱ型原核CRISPR 自适应免疫系统的基因组编辑工具，由RNA 引导Cas9核酸酶对DNA 进行靶向编辑［11］。CRISPR/Cas 系统存在于约40%的细菌和90%的古生菌中，用于抵抗外源的DNA 片段［12］。化脓性链球菌Streptococcus pyogenes 中的Ⅱ型CRISPR 系统组成比较简单，易于构建和使用，其中包括Cas9 核酸酶和两个非编码RNA:一个成熟的CRISPR RNA(crRNA)和一个部分互补的反式作用RNA(tracrRNA)，这3 个组分能够有效地沉默外源DNA［13］。目前，研究者已成功构建小引导RNA(sgRNA)优化CRISPR/Cas 系统。sgRNA 包含3 个结构域:约20 nt 的互补区决定其与DNA 结合的特异性;约42 nt 的发夹结构域模拟tracrRNA-crRNA复合物，能够与Cas9 结合;此外，还包括一个约40 nt的转录终止子。结合特异性由sgRNA-DNA 碱基配对和DNA 互补区上游的前间隔相邻基序(protospacer adjacent motifs，PAM)决定［14］。CRISPR 系统只需要Cas9 蛋白和sgRNA 就能够进行宿主非依赖性的基因打靶，将表达Cas9 和sgRNA 的质粒转入细胞后，Cas9 蛋白与sgRNA 结合形成蛋白-RNA 复合物，该复合物与DNA 靶位通过碱基配对特异性结合后，靶位DNA 在核酸内切酶Cas9 的作用下形成DSB［15］。

使用CRISPR/Cas 系统对基因组进行定点编辑不需要构建大分子质量的核酸酶，只需要设计引导RNA 就能对几乎任意序列进行靶向编辑。该系统已成功应用于微生物、动物细胞和转基因动物，并可以同时作用于多个靶位［16］。CRISPR/Cas 系统与ZFN 和TALEN 相比，具有更好的扩展性，更加经济实惠、易于构建。

2.4 人工大范围核酸内切酶

大范围核酸内切酶广泛存在于微生物中，能够识别较长的DNA 序列(＞12 bp)，具有较好的特异性。但是，目前已知的MN 较少，不能覆盖所有的靶位点，不能够作为切割特异性位点的工具。为此，研究者试图人工构建更多的MN 以供使用:使用突变的方法构建识别特异序列的MN［17－18］;有研究者将不同的酶融合在一起形成杂交酶，识别新的序列［19］;另外，“rationally designed meganuclease”方法(US Patent No:8338157、8304222)是改变与DNA 相互作用的氨基酸来设计特异性位点的MN。最近，有研究人员成功应用MN 构建了基因敲除小鼠和大鼠［20］。MN 与靶位的识别比较严格，因此其毒性可能小于以上几种人工核酸酶。由于MN 种类的限制，目前还不能大范围应用于基因组定点修饰。

3 展望

ZFN、TALEN 和CRISPR/Cas 系统作为基因组定点修饰工具的应用具有革命性意义。长期以来，ZFP是唯一能够提供与DNA 定点结合的蛋白和酶的技术，但方法本身的复杂性限制了它的应用。直到TALE 与DNA 特异性识别的分子密码被破解后，研究人员借鉴ZFN 的策略对天然的TALE 进行改造，使其成为基因组定点编辑的工具，由于其技术门槛较低，一出现就得到了广泛的研究和应用。而最近发展起来的CRISPR/Cas 系统似乎可以更简便地进行基因组编辑。虽然这些基因组编辑工具的效率、毒性等还需要进一步评估，但随着研究的深入，人工核酸酶技术的进步必然推动基础医学和个体化治疗的发展。

［1］Rosenbloom KR，Sloan CA，Malladi VS，et al．ENCODE data in the UCSC genome browser:year 5 update［J］．Nucleic Acids Res，2013，41:56－63．

［2］Gaj T，Gersbach CA，Barbas CF，et al．ZFN，TALEN，and CRISPR/Cas-based methods for genome engineering［J］．Trends Biotechnol，2013，31:397－405．

［3］Mohr SE，Perrimon N．RNAi screening:new approaches，understandings，and organisms［J］．Wiley Interdiscip Rev RNA，2012，3:145－158．

［4］Pan Y，Xiao L，Li AS，et al．Biological and biomedical applications of engineered nucleases［J］．Mol Biotechnol，2013，55:54－62．

［5］de Souza N．Primer:genome editing with engineered nucleases［J］．Nat Methods，2012，9:27．

［6］Palpant NJ，Dudzinski D．Zinc finger nucleases:looking toward translation［J］．Gene Ther，2013，20:121－127．

［7］Carroll D．Genome engineering with zinc-finger nucleases［J］．Genetics，2011，188:773－782．

［8］Bhakta MS，Henry IM，Ousterout DG，et al．Highly active zinc-finger nucleases by extended modular assembly［J］．Genome Res，2013，23:530－538．

［9］Joung JK，Sander JD．TALENs:a widely applicable technology for targeted genome editing［J］．Nat Rev Mol Cell Biol，2013，14:49－55．

［10］Mussolino C，Morbitzer R，Lutge F，et al．A novel TALE nuclease scaffold enables high genome editing activity in combination with low toxicity［J］．Nucleic Acids Res，2011，39:9283－9293．

［11］Wiedenheft B，Sternberg SH，Doudna JA．RNA-guided genetic silencing systems in bacteria and archaea［J］．Nature，2012，482:331－338．

［12］Makarova KS，Haft DH，Barrangou R，et al．Evolution and classification of the CRISPR-Cas systems［J］．Nat Rev Microbiol，2011，9:467－477．

［13］Gasiunas G，Barrangou R，Horvath P，et al．Cas9-crRNA ribonucleoprotein complex mediates specific DNA cleavage for adaptive immunity in bacteria［J］．Proc Natl Acad Sci U S A，2012，109:2579－2586．

［14］Jinek M，Chylinski K，Fonfara I，et al．A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity［J］．Science，2012，337:816－821．

［15］Cong L，Ran FA，Cox D，et al．Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems［J］．Science，2013，339:819－823．

［16］Wang H，Yang H，Shivalila CS，et al．One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering［J］．Cell，2013，153:910－918．

［17］Seligman LM，Chisholm KM，Chevalier BS，et al．Mutations altering the cleavage specificity of a homing endonuclease［J］．Nucleic Acids Res，2002，30:3870－3879．

［18］Rosen LE，Morrison HA，Masri S，et al．Homing endonuclease I-CreI derivatives with novel DNA target specificities［J］．Nucleic Acids Res，2006，34:4791－4800．

［19］Smith J，Grizot S，Arnould S，et al．A combinatorial approach to create artificial homing endonucleases cleaving chosen sequences［J］．Nucleic Acids Res， 2006，34:149．

［20］Menoret S，Fontaniere S，Jantz D，et al．Generation of Rag1-knockout immunodeficient rats and mice using engineered meganucleases［J］．FASEB J，2013，27:703－711．