硅藻硝酸消化法与浮游生物16S rDNA PCR法在溺死鉴定中的比较

韩军鸽，王程宝，李兴彪，范琰琰，冯相平

（1.温州医科大学法医学系，浙江温州 325035；2.皖南医学院法医学院，安徽芜湖 241002）

·技术与应用·

硅藻硝酸消化法与浮游生物16S rDNA PCR法在溺死鉴定中的比较

韩军鸽1，王程宝2，李兴彪1，范琰琰1，冯相平1

（1.温州医科大学法医学系，浙江温州 325035；2.皖南医学院法医学院，安徽芜湖 241002）

目的比较和探讨硅藻硝酸消化法与浮游生物16S rDNA PCR法在溺死鉴定中的应用价值。方法收集40例温州医科大学法医学系2010—2011年受理并证实溺死的鉴定案件，每例案件标本包括肺、肾、肝及现场水样4份样本，分别运用硅藻硝酸消化法与浮游生物16S rDNA PCR法对标本进行检验，硅藻硝酸消化法和浮游生物16S rDNA PCR法所需各器官检材量分别为约20g和2g，现场水样分别为15mL和1.5mL，从所需检验时间以及检出率等方面进行比较分析。结果硅藻硝酸消化法检出硅藻主要为中心硅藻纲和羽纹硅藻纲，浮游生物16S rDNA PCR法可扩增出一条162bp的条带。平均检验每例案件所需的检验时间，硅藻硝酸消化法为（95.30±2.78）min，少于浮游生物16S rDNA PCR法（325.33±14.18）min（P＜0.05）。两种方法对现场水样及肺样本的检出率均为100%，而对肝及肾样本的检出率，浮游生物16S rDNA PCR法均为80%，高于硅藻硝酸消化法40%和30%（P＜0.05）。结论在溺死的法医学鉴定中，应根据具体情况来挑选合适的实验室检验方法。与硅藻硝酸消化法相比，浮游生物16S rDNA PCR法具有检材用量少、信息量大、特异性高等特点，有一定的推广和实践价值。

法医病理学；溺水；16S rDNA；聚合酶链反应；硝酸消化法；浮游生物；硅藻类

在法医学检案中，溺死的鉴定始终是法医工作者所关注的重点和难点之一。在实践中，水中尸体被发现时常处于晚期腐败状态，此时较有意义的溺死尸体征象多遭到破坏或已消失，单凭尸表征象和尸体解剖很难鉴定溺死。实验室检查中，水中尸体器官中的硅藻检验一直是鉴定溺死的重要辅助手段，但其在鉴定溺死的可靠性上仍有争议[1-3]。近年来，随着分子生物学技术的发展和多学科技术的交叉应用，国内外许多法医工作者通过检验水中尸体器官中浮游生物16S rDNA PCR法进行溺死的鉴定[4-7]。本研究针对运用国内普遍采用的硅藻硝酸消化法与PCR扩增浮游生物16S rDNA V3、V4可变区序列的方法进行比较分析，为溺死的实验室检查方法的选取提供理论依据，并探讨其应用价值。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 研究对象

收集2010—2011年温州医科大学法医学系硅藻实验室所受理的已确定为溺死案件40例，每例案件标本同时包括肺、肾、肝及现场水样4份样本。其中男性24例，女性16例，年龄16～58岁。

1.1.2 仪器与试剂

Eppendorf 5804R离心机（德国Eppendorf公司）；UNIVERSAL 32R离心机（德国Hettich公司）；Olympus CX21显微镜（日本Olympus公司）；PC-815 PCR仪（日本Astec公司）；电泳仪（北京市六一仪器厂）；Nikon P90数码相机（日本Nikon公司）；浮游生物16S rDNA V3、V4可变区引物[4，6]（上海桑尼生物科技有限公司），其中包括V3引物（AAGAAGAAGATCTGACGGT）和V4引物（GGAGTTAAGCTCCACGCTTT）；浓硝酸（浓度65%～68%）和国产分析纯等。

1.2 方法

对40例案件标本包括肺、肾、肝及现场水样4份样本分别进行硅藻硝酸消化法、浮游生物16S rDNA PCR法两种方法检验。检验结果均用Nikon P90数码相机拍照存档，对送检器官与现场水样中的硅藻种类（浮游生物条带）进行比较确认结果，并记录每例案件从开始检验到结束所用时间。

1.2.1 硅藻硝酸消化法

取送检的肺、肝及肾边缘组织20g，放入1000mL烧杯里剪碎，加入浓硝酸50mL，加热消化，待冷。以离心半径10 cm，4 000 r/min，离心15 min，去其上清液，加入蒸馏水，再以离心半径10 cm，4 000 r/min，离心15min，去其上清液，将沉淀液逐滴滴在载玻片上、烘干、环氧树脂封固镜检。取送检现场水样标本15mL用上述同样方法离心、镜检。

1.2.2 浮游生物16S rDNA PCR法

取送检的肺、肝及肾组织各2g，剪碎并加入4mL双蒸水后用匀浆器匀浆。匀浆后以离心半径8 cm，6 000 r/min，离心5 min，取上清液以离心半径8 cm，12000r/min，离心10min，弃上清液，双蒸水洗涤1次后，向沉渣中加入5%Chelex-100 150μL，-80℃冷冻60 min，再按Chelex-100法提取DNA。取现场水样1.5mL，以离心半径10cm，12000r/min，离心10min，双蒸水洗涤1次，向沉渣中加入5%Chelex-100 150μL，-80℃冷冻60min，再按Chelex-100法提取DNA[4]。

进行PCR扩增的反应体系为10 μL，内含200 μmol/L dNTPs，50 mmol/L KCL，10 mmol/L Tris-HCl，1.5mmol/L MgCl2，0.5μmol/L V3引物，0.5μmol/L V4引物，0.5 U Taq DNA聚合酶，0.16 μg/μL小牛血清白蛋白，模板DNA 4μL。PCR热循环参数为：95℃2 min；94℃30 s，60℃40 s，72℃40 s，35个循环；72℃10min。扩增产物采用聚丙烯酰胺凝胶（T=6%，C=5%）电泳，银染检验。

1.3 统计学分析

计算两种方法检验平均每例案件所用检验时间均值，结果以x ±s表示；比较两种方法对各器官及现场水样的检出结果并计算检出率；应用SPSS 11.0统计软件对数据进行处理，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 硅藻硝酸消化法与浮游生物16S rDNA PCR法检测结果

硅藻硝酸消化法可检出藻类主要有中心纲圆筛藻属、中心纲小环藻属、羽纹纲舟形藻属以及羽纹纲棒形藻属等（图1），PCR扩增浮游生物16S rDNA法在肺、肾、肝及现场水样中可见162bp的扩增条带（图2）。

2.2 检验时间以及检出率比较结果

两种方法检验每例案件所用的检验时间见表1，硅藻硝酸消化法的检验时间少于浮游生物16S rDNA检验法，差异具有统计学意义（P＜0.05）；两种方法对各器官及现场水样的检出数（率）见表2，两种方法对现场水样及肺的检出率相同均为100%，而对肝及肾的检出率，浮游生物16S rDNA检验法高于硅藻硝酸消化法，差异具有统计学意义（P＜0.05）。

图2 浮游生物16S rDNA PCR法检测结果

表1 两种方法检验每例案件所用的检验时间（n=40，x ±s，min）

表2 两种方法检验每例案件的检出数（率）［例（%）］

3 讨论

浮游生物是指生活于水中而缺乏有效移动能力的漂流生物，其中分有浮游植物及浮游动物[8]。硅藻是广泛存在于自然界的单细胞低等浮游植物，以水中含量最为丰富。在溺水过程中，携带浮游生物的溺液通过溺水者主动呼吸进入肺泡，使肺泡扩张，造成毛细血管膜的微小损伤，溺液中微小的浮游生物可穿过损伤的血管膜，进入肺静脉循环，再到左心，后随体循环到达全身各器官；而死后再被抛入水中的尸体，虽无主动呼吸，但可通过扩散和渗透的方式使少量的浮游生物进入肺泡而不会随体循环进入体内其他器官[9]。因此，通过检验溺死者肺及其他器官组织中的浮游生物种类和数量，与尸体被发现现场水样进行对比，是鉴定溺死的重要辅助手段。本研究通过对40例溺死案例分别运用硅藻硝酸消化法与浮游生物16S rDNA PCR法对现场水样及溺死尸体不同器官进行对比研究，并探讨两种方法在溺死鉴定中的应用价值，为溺死的实验室检查方法的选取提供理论依据。

本研究中，为防止干性溺死、浴室及游泳池内溺死等情况对本实验的影响，故在选取案例时，要确定选取的送检器官及现场水样中存在浮游生物，而结果显示两种方法对现场水样及肺的检出率相同均为100%，故验证了所选取的案例的确均为溺死。本研究所采用的硅藻硝酸消化法在检材需求量、实验试剂及检验步骤等方面是本系硅藻实验室根据实际条件及长期实践的经验总结，而据国内外报道[10-12]硅藻硝酸消化法的实验试剂及检验步骤基本相同，检材需求量为5、20、30及50g，可能与各个实验室条件及要求不同，但检验结果相差不大。据报道[4-7]，浮游生物16S rDNA PCR法有很多种，检出率均较高，而在检材需求量方面具有很大差异，有1 mg、30 mg、1 g及2 g不等。本研究根据实验室实际情况采用PCR扩增浮游生物16S rDNA V3、V4可变区序列的方法，检材需求量为2g，检出率与报道[6]基本一致。

在水中尸体的实验室检验方法中，国内基层公安系统及司法鉴定机构最常用的是硅藻硝酸消化法，因其检验时间短（消化能力强、消化时间短）、设备和试剂经济等优点，应用已比较成熟，易于操作、推广普遍，在溺死的法医学鉴定中一直被认为是首选的检验方法。然而，硅藻硝酸消化法虽在溺死鉴定中发挥了很大的作用，但随着科学技术的发展和对环境保护的认识，其局限性越来越受到注意：（1）硝酸对硅藻的破坏性强，检材需求量大，灵敏度低；（2）检验过程中会灼伤实验员，危险性大；（3）检验过程中会产生二氧化氮和强酸废液，环境污染大；（4）对实验室洁净度要求高，影响因素多，故存在假阴性或假阳性。

浮游生物16S rDNA PCR法是利用PCR技术检验水中尸体器官组织内是否存在浮游生物16S rDNA标记。此法与硅藻硝酸消化法相比较，具有以下优势：（1）检材需求量小，灵敏度高；（2）检验过程安全、环境污染少；（3）信息量丰富，鉴别能力强，检出率高；（4）建立地域性浮游生物群落特征多样性数据库，可应用于推断溺死地点和时间。然而，浮游生物16S rDNA PCR法与硅藻硝酸消化相比，也存在不足之处：（1）检验时间相对较长；（2）对实验人员要求较高，应具备一定的分子生物学专业背景；（3）检验仪器、试剂等投入成本较高；（4）因其灵敏度高，若死者生前长期生活在含浮游生物量高的地区，会造成较高的假阳性。

4 小结

在溺死的法医学鉴定中，要根据具体情况来挑选适当的检验方法；与传统的硅藻硝酸消化法相比，浮游生物16S rDNA PCR法具有检材用量少、信息含量大、特异性高、抗污染能力强、检验范围广等优点，有一定的推广和实践价值。

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（本文编辑：张建华）

Comparative Analysis between Diatom Nitric Acid Digestion Method and Plankton 16S rDNA PCR Method

HAN Jun-ge1,WANG Cheng-bao2,LI Xing-biao1,FAN Yan-yan1,FENG Xiang-ping1
（1.Department of Forensic Medicine,Wenzhou Medical University,Wenzhou 325035,China;2.School of Forensic Medicine,Wannan Medical College,Wuhu 241002,China）

ObjectiveTo compare and explore the application value of diatom nitric acid digestion method and plankton 16S rDNA PCR method for drowning identification.MethodsForty drowning cases from 2010 to 2011 were collected from Department of Forensic Medicine of Wenzhou Medical University. Samples including lung,kidney,liver and field water from each case were tested with diatom nitric acid digestion method and plankton 16S rDNA PCR method,respectively.The Diatom nitric acid digestion method and plankton 16S rDNA PCR method required 20g and 2g of each organ,and 15mL and 1.5mL of field water,respectively.The inspection time and detection rate were compared between the two methods.ResultsDiatom nitric acid digestion method mainly detected two species of diatoms,Centriae and Pennatae,while plankton 16S rDNA PCR method amplified a length of 162bp band.The average inspection time of each case of the Diatom nitric acid digestion method was（95.30±2.78）min less than （325.33±14.18）min of plankton 16S rDNA PCR method（Plt;0.05）.The detection rates of two methods for field water and lung were both 100%.For liver and kidney,the detection rate of plankton 16S rDNA PCR method was both 80%,higher than 40%and 30%of diatom nitric acid digestion method（Plt;0.05）, respectively.ConclusionThe laboratory testing method needs to be appropriately selected according to the specific circumstances in the forensic appraisal of drowning.Compared with diatom nitric acid digestion method,plankton 16S rDNA PCR method has practice values with such advantages as less quantity of samples,huge information and high specificity.

forensic pathology;drowning;16S rDNA;polymerase chain reaction;nitric acid digestion method;plankton;diatoms

DF795.1

A

10.3969/j.issn.1004-5619.2013.05.010

1004-5619（2013）05-0356-04

浙江省教育厅科研资助项目（Y201016768）

韩军鸽（1977—），女，河南许昌人，博士，讲师，主要从事法医分子遗传学研究及鉴定工作；E-mail：hanjunge@wzmc. edu.cn

2012-11-01）