中国朝鲜族H19基因上游差异甲基化区SNP分布

韦文滔，王鑫，王冬梅，田璐源，王保捷，庞灏，丁梅

（1．中国医科大学法医学院，辽宁沈阳 110001；2.苏州市吴江区公安局，江苏吴江 215200；3.苏州市公安局，江苏苏州 215000）

中国朝鲜族H19基因上游差异甲基化区SNP分布

韦文滔1，2，王鑫1，3，王冬梅1，田璐源1，王保捷1，庞灏1，丁梅1

（1．中国医科大学法医学院，辽宁沈阳 110001；2.苏州市吴江区公安局，江苏吴江 215200；3.苏州市公安局，江苏苏州 215000）

目的调查中国朝鲜族群体中H19基因上游差异甲基化区（differentially methylated region，DMR）SNP及单倍型分布，为法医学应用及群体遗传学研究提供基础数据。方法收集中国朝鲜族101份无关个体血样和14份来自5个亲缘关系已知的两代家系血样，用PCR-循环测序、McrBC消化DNA后PCR方法检测H19基因上游DMR的SNP，并用亲源印记等位基因（parentally imprinted allele，PIA）分型法进行单倍型检测，再计算相关遗传学参数。结果在H19基因上游DMR 1174bp的目的基因扩增产物中，共检出13个SNP（rs10840167、rs2525883、rs12417375、rs4930101、rs2525882、rs2735970、rs2735971、rs11042170、rs2735972、rs10732516、rs2071094、rs2107425、rs4930098）和5种单倍型，有9个SNP属于高鉴别能力的遗传标记，其单倍型具有较高的个人识别率，单倍型平均基因多样性（GD）为0.714。应用McrBC酶消化基因组DNA的PIA分型法确定了家系子代样本的母源单倍型。结论H19基因上游DMR在中国朝鲜族群体中具有很高的遗传多态性，母源单倍型的确定进一步提高了印记基因的法医学鉴定效能。

法医遗传学；多态性，单核苷酸；DNA甲基化；H19基因；朝鲜族

人类体细胞的两条染色体，一条来自父亲，一条来自母亲，绝大多数基因座的父源和母源等位基因等量表达，但在某些基因座上，只有亲代一方的等位基因有表达活性，而另一方的等位基因无表达活性或者表达活性低，这种亲源依赖的差异表达现象称为基因组印记（genomic imprinting）。在基因印记形成过程中差异甲基化被认为起着关键作用，即某特定亲本等位基因在含有CpG岛的序列出现了甲基化，而另一亲本等位基因在该序列未出现甲基化，该序列称为差异甲基化区（differentially methylated region，DMR）。印记基因的研究在法医个人识别及亲权鉴定方面具有特殊的意义。Naito等[1]以特定限制性内切酶处理后的基因组DNA为模板，应用亲源印记等位基因（parentally imprinted allele，PIA）分型法选择性扩增父源或母源DNA目的片段，确定了一个可变数目串联重复序列（variable number of tandem repeats，VNTR）位点的亲代来源。Zhao等[2]通过甲基化特异性PCR（methylation-specific PCR，MS-PCR）方法来检测印记基因小核核糖核苷酸蛋白N（small nuclear ribonucleotide protein N，SNRPN）上SNP的母源等位基因。此外有研究[3]发现，H19基因上游DMR的SNP在不同的国家和地区群体中的分布情况存在着一定的差异，并且非洲、德国、日本等群体中存在着特有的SNP。人类H19基因是印记基因簇中的一个父源印记基因，即父源等位基因高度甲基化而不表达，母源等位基因非甲基化而表达。

本研究应用DNA测序技术调查中国朝鲜族群体中H19基因上游DMR的SNP分布，并用PIA分型法进行单倍型检测和家系分析。

1 材料与方法

1.1 样本及DNA提取

收集中国朝鲜族101份健康无关个体血样和14份来自5个亲缘关系已知的两代家系血样，由中国医科大学法医学院法医血清教研室提供。

1.2 引物合成

根据文献[3]合成扩增H19基因上游DMR的4条引物（表1，图1）。H19R4和H19SF3扩增产物长548bp，H19SF3和H19R7扩增产物长1174bp，H19R7 和H19CF2扩增产物长664 bp。引物对H19SF3和H19R7用于目的基因扩增；引物对H19R4和H19SF3、H19R7和H19CF2用于单倍型分析。

表1 H19基因上游DMR扩增引物序列

图1 4条引物在H19基因上游DMR的相对位置

1.3 SNP检测

1.3.1 目的基因扩增

对中国朝鲜族101份健康无关个体血样和14份来自5个亲缘关系已知的两代家系血样的H19基因上游DMR进行PCR扩增。扩增总体积为12.5 μL，包括模板DNA 2 μL（10～40 ng/μL）、引物对各1 μL、Hotstar Taq®Plus Master mixture 5 μL、去离子水3.5 μL。扩增条件：95℃5min；95℃30s，55℃45s，72℃90s，共35个循环；72℃5min。

1.3.2 扩增产物分析

分别以H19SF3和H19CF2为测序引物，以H19基因上游DMR扩增产物为模板进行PCR测序反应，具体方法参照BigDye Terminator v1.1试剂盒（美国AB公司）的PCR产物测序标准流程，并用3130型DNA自动测序仪（美国AB公司）测定其扩增产物的DNA序列。

1.4 PIA分型

1.4.1 模板制备

DNA测序分析为杂合子的朝鲜族个体及家系分析中子代个体的基因组DNA均用限制性内切酶McrBC消化处理。酶切体系为McrBC 5U，BSA 1 μL，GTP 1 μL，10×缓冲液1 μL，基因组DNA（10～40 ng/μL）2 μL，去离子水补至10 μL。酶切条件为37℃水浴消化3h，65℃水浴灭活10min。

1.4.2 母源等位基因检测

以McrBC酶切产物为模板，分别用H19R4和H19SF3、H19R7和H19CF2两对引物进行PCR扩增。扩增体系组成、扩增条件及扩增产物分析方法同1.3项。

1.5 数据分析

直接计数法统计各SNP碱基突变类型例数后，计算各SNP的基因型频率和等位基因频率。用χ2检验进行Hardy-Weinberg平衡检验。通过PIA分型法确定单倍型、单倍型组合并计算单倍型频率。用Haploview 4.1软件分析各SNP的连锁不平衡，用PowerStats v12软件包计算相关群体遗传学参数。

2 结果

2.1 H19基因上游DMR的SNP分布

朝鲜族101份健康无关个体血样H19基因上游DMR 1 174 bp的目的片段中，共检出13个SNP （rs10840167、rs2525883、rs12417375、rs4930101、rs2525882、rs2735970、rs2735971、rs11042170、rs2735972、rs10732516、rs2071094、rs2107425、rs4930098），各SNP频率分布及群体遗传学参数见表2。经吻合度检验，检出的H19基因上游DMR的13个SNP的P值均大于0.05，均符合Hardy-Weinberg平衡定律，证明本研究的数据可信。

13个SNP中，除rs12417375位点外均检出2种等位基因构成的3种基因型。其中分别有两组2个 SNP位点（rs2735970与rs2107425，rs2735971与rs2735972）和一组6个SNP位点（rs10840167、rs4930101、rs11042170、rs10732516、rs2071094、rs4930098）的基因型频率相同，通过Haploview 4.1软件分析结果显示，13个SNP处于连锁不平衡（表3）。

2.2 H19基因上游DMR单倍型分布

101份中国朝鲜族健康无关个体血样H19基因上游DMR检出的13个SNP位点，构成了12种单倍型组合，经PIA分型进一步检测共确认了5种单倍型，根据其频率从高到低依次命名为单倍型Ⅰ～Ⅴ（表4）。经计算，中国朝鲜族单倍型的平均基因差异度（GD）为0.714，杂合度（H）为0.673，多态信息含量（PIC）为0.660，非父排除率（PE）为0.388。

H19基因上游DMR扩增产物DNA测序确定的5个家系14份样本的单倍型组合见表5，其中家系1的被控父不能提供作为孩子亲生父亲必须提供的单倍型而被排除父权。家系2～5的被控父中可检见与孩子相同的单倍型，不能排除其父权，但其中家系2孩子的单倍型Ⅱ，经PIA分型确定为母源等位基因构成的单倍型，据此排除父权。

表2 中国朝鲜族H19基因上游DMR的SNP频率分布及群体遗传学参数（n=101）

3 讨论

3.1 H19基因上游DMR的SNP群体分布

基因组印记是指由于表观遗传学水平的修饰特意地沉默某一亲代来源的等位基因的现象，这种在生物进化中形成、有规律而又受控的基因失活是机体中基因表达调节的一种重要方式。H19基因是研究较早的一个印记基因，它位于人类染色体11p15.5区域，表达为一种功能尚不清楚的RNA。H19基因上游2.5～7.6kb的DMR是SNP位点较多的区域。迄今为止，在序列号AF125183碱基位置7149～8217，已报道的有23个SNP位点，但有关中国人H19基因上游DMR的SNP分布的群体调查研究尚不充分。本研究中国朝鲜族群体H19上游DMR目的基因片段内检出的13个SNP位点中，未发现新的变异点和人群特有的SNP位点。Nakayashiki等[3]报道的日本群体的Jp-sp1，加纳群体的Af-sp1、Af-sp2、Af-sp3、Af-sp4、Af-sp5、Af-sp6及德国群体的Ge-sp1、Ge-sp2等SNP位点也未在中国朝鲜族群体中检出。

本群体调查数据和中国汉族（武汉）群体调查数据[4]比较，H19印记基因DMR在中国朝鲜族群体中具有更高的遗传多态性。H19印记基因DMR的7 342～8 008 bp范围内，中国朝鲜族群体检出的8个SNP（rs2525882、rs2735970、rs11042170、rs2107425、rs2735971、rs2735972、rs10732516、rs2071094）位点中，仅有4个位点（rs2525882、rs2735970、rs11042170、rs2107425）在中国汉族群体检出多态性，两个群体间除rs11042170外，其余3个SNP等位基因频率分布存在显著性差异；而中国汉族群体检出的序列AF125183 中7 351 bp碱基突变却未能在中国朝鲜族群体中检出。由此可见，H19印记基因DMR的SNP分布在不同人种、不同地区、不同民族间均存在差异，是人类遗传学研究的良好遗传标记。

3.2 法医学意义

SNP作为第三代遗传标记，含量丰富，有较高的遗传稳定性，在法医物证检验领域有重要的应用价值。但SNP多为二等位基因，信息量有限，提供更多的SNP检测才能达到较高的个人识别能力。本研究在中国朝鲜族群体共检出了H19基因上游DMR的13个SNP，其中9个SNP位点的DP＞0.5，属于高鉴别能力遗传标记，是个人识别及亲子鉴定较为理想的候选SNP位点。根据遗传学理论，分布在H19基因上游DMR仅1174bp片段内检出的13个SNP位点是连锁遗传标记，通过计算其单倍型频率求得其平均GD、H、PIC及PE分别为0.714、0.673、0.660、0.388，说明该遗传标记系统在法医学鉴定中具有较好的实用价值。本研究实际检出的单倍型数目远低于理论推测的8 192种可能单倍型数目，其原因在于部分位点呈紧密连锁关系。因此如果通过重新设计能够选择性扩增6个相邻非连锁位点的引物，可以明显缩短目的基因扩增片段，以适应降解检材DNA分型的需要，同时又可保证与1174bp扩增片段SNP分型相同的法医学鉴定效能。

人类H19基因上游DMR富含CpG岛，CpG位点父源等位基因呈甲基化状态，母源等位基因呈非甲基化，即H19基因在正常组织内为母源等位基因表达、父源等位基因印记，为单倍型分析及等位基因的亲源鉴定提供了一种新的思路。根据H19基因上游DMR的分子生物学特征，Yamada等[5]利用HpaⅡ、McrBC对5-甲基化胞嘧啶和非甲基化胞嘧啶的不同敏感程度，建立了广泛用于DNA甲基化检测的Hpa Ⅱ-McrBC PCR方法。McrBC是一种作用于含有甲基胞嘧啶DNA的特异性核酸内切酶，能够特异性地识别和切割包含两个（G/A）mC间距在40～2 000 bp的DNA序列。本研究以限制性内切酶McrBC消化后的基因组DNA为模板进行PCR扩增及DNA测序分析，由于H19基因上游DMR甲基化的父源DNA链被消化，其检测结果只反映母源等位基因及其构成的母源单倍型。这种PIA分型方法，可以鉴别两个个体具有的相同等位基因（或单倍型）是否同源，在亲缘关系鉴定，特别是单亲、同胞（或半同胞）等的亲缘关系鉴定中，以及个人识别中均具有特殊的意义。

[1]Naito E，Dewa K，Fukuda M，et al. Novel paternity testing by distinguishing parental alleles at a VNTR locus in the differentially methylated region upstream of the human H19 gene[J]. J Forensic Sci，2003，48（6）：1275-1279.

[2]Zhao G，Yang Q，Huang D，et al. Study on the application of parent-of-origin specific DNA methylation markers to forensic genetics[J]. Forensic Sci Int，2005，154（2-3）：122-127.

[3]Nakayashiki N，Shimamoto K，Takamiya M，et al. Investigation of SNP haplotypes in the H19 imprinted gene[J]. Forensic Science International：Genetics Supplement Series，2009，2（1）：540-541.

[4]Huang D，Lin X，Chen H，et al. Parentally imprinted allele（PIA）typing in the differentially methylated region upstream of the human H19 gene[J]. Forensic Sci Int Genet，2008，2（4）：286-291.

[5]Yamada Y，Watanabe H，Miura F，et al. A comprehensive analysis of allelic methylation status of CpG islands on human chromosome 21q[J]. Genome Res，2004，14（2）：247-266.

（本文编辑：柳燕）

SNP in Differentially Methylated Region Upstream of H19 Gene in Chinese Korean Nationality

WEI Wen-tao1,2,WANG Xin1,3,WANG Dong-mei1,TIAN Lu-yuan1,WANG Bao-jie1,PANG Hao1,DING Mei1
（1.School of Forensic Medicine,China Medical University,Shenyang 110001,China;2.Suzhou Wujiang Public Security Bureau,Wujiang 215200,China;3.Suzhou Public Security Bureau,Suzhou 215000,China）

ObjectiveTo investigate SNP and distribution of haplotypes in differentially methylated region （DMR）upstream of H19 gene in Chinese Korean nationality in order to provide basic data for forensic application and population genetics research.MethodsOne hundred and one blood samples from unrelated Chinese Korean individuals and 14 blood samples from 5 Chinese Korean intergenerational families which known genetic relationship were collected.The SNP in DMR upstream of H19 gene were investigated by PCR-cycle sequencing and McrBC digestion followed by PCR.The haplotypes detected by parentally imprinted allele（PIA）method and relevant genetic parameters were calculated.ResultsThirteen SNPs（rs10840167,rs2525883,rs12417375,rs4930101,rs2525882,rs2735970,rs2735971,rs11042170, rs2735972,rs10732516,rs2071094,rs2107425,and rs4930098）and five haplotypes were detected in 1174bp target product in DMR upstream of H19 gene,with 9 SNPs having high discrimination power as good genetic markers.The average gene diversity（GD）of haplotypes was 0.714.The maternal haplotype was confirmed correctly by PIA method from McrBC-digested products of genomic DNA.ConclusionHigh polymorphisms exist in DMR upstream of H19 gene in Chinese Korean nationality.And determination of the maternal haplotype could furthermore enhance the forensic identification efficiency of imprinted gene.

forensic genetics;polymorphism,single nucleotide;DNA methylation;H19 gene;the Korean nationality

DF795.2

A

10.3969/j.issn.1004-5619.2013.05.011

1004-5619（2013）05-0360-05

韦文滔（1986—），男，壮族，广西来宾人，硕士研究生，主要从事DNA多态性研究；E-mail：weiwentao0311@163.com

丁梅，女，教授，博士研究生导师，主要从事法医物证学鉴定和研究；E-mail：dingmei1209@gmail.com

2012-05-09）