木犀草素预处理减轻H2O2诱导的乳鼠心肌细胞凋亡

印媛君，余美荣，蒋福生，丁志山

(浙江中医药大学1.基础医学院生理教研室;2.生命科学院分子遗传教研室，浙江杭州310053)

心脏疾病发病率的逐年增加，已经引起越来越多医务人员以及普通老百姓的关注，如何预防以及减低发病率已经成为越来越多人关心的问题了。木犀草素(luteolin)是一种天然黄酮类化合物，多以糖苷形式存在于多种植物中，具有多种药理活性，尤其在对心血管保护方面的作用被逐渐重视，如对氧化应激大鼠心肌的保护［1］，对阿霉素损伤的心肌细胞的保护［2］以及对冷保存心脏功能的保护［3］等。本研究对木犀草素预处理后对H2O2诱导的心肌细胞损伤的影响做了初步研究，探讨木犀草素在心血管疾病预防中可能发挥的意义，以期为该化合物的进一步研究提供一定的依据，以及为如何有效预防心血管疾病的发生提供一定的实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

新生1 ～3 d 的SD 乳鼠，购于浙江省医学科学院实验动物中心，动物合格证号 SYXK (浙)2009-0001。

1.2 实验药品

木犀草素(纯度大于97%)，(浙江天草生物制品有限公司);高糖DMEM 培养基(Gibogo 公司);胎牛血清(Hyclone 公司);Hoechst33342-PI(碧云天生物技术研究所);胰蛋白酶(1∶250)，5-溴-2-脱氧尿嘧啶(5-bromo-2-deoxyuridine)，噻唑蓝(MTT)(Sigma公司);乳酸脱氢酶(LDH)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)。

1.3 方法

1.3.1 心肌细胞的原代培养方法见文献［4］。

1.3.2 MTT 法测心肌细胞存活力:心肌细胞悬液接种到96 孔板，分7 组，每组6 孔。设置对照组、模型组和木犀草素预处理组。另设无细胞空白孔，消除培养基对吸光度的影响。对照组(control):以含10%胎牛血清DMEM 培养细胞;模型组(model):培养后，在培养基中加入终浓度为1 mmol/L 的H2O2孵育2 h;木犀草素预处理组:培养后，用不同浓度的木犀草素预处理2 h，随后每孔加入终浓度为1 mmol/L H2O2的培养液处理2 h 后每孔内再加MTT 20 μL(5 g/L)，继续培养4 h，吸去各孔中含MTT 的培养液，每孔加DMSO 100 μL，混合均匀后用酶标仪测A 值(测定波长490 nm)。根据下式计算药物对H2O2诱导心肌细胞损伤的抑制百分比。损伤抑制率(%)=(A drug－A model)×100/(A control－A model)。

1.3.3 分组及药物处理:根据MTT 活性及损伤抑制率的测定，木犀草素预处理组选择浓度为100 μmol/L。故实验分成3 组，即对照组、模型组和木犀草素预处理组(100 μm 木犀草素预处理2 h+1 mmol/L H2O2处理2 h)。

1.3.3.1 细胞形态学观察:长在6 孔板中的细胞，各组在相差倒置显微镜观察并照相，观察各组细胞形态学变化。

1.3.3.2 心肌细胞搏动频率的测定:不同处理后的心肌细胞，显微镜下观察并计数心肌细胞的搏动频率。每孔选8 个细胞或同步收缩的细胞簇，镜下计数心肌细胞跳动1 min，重复两次。

1.3.3.3 Hoechst33342-PI 双染色后观察细胞系染色，测量细胞凋亡。

1.3.3.4 荧光染料罗丹明123(Rh123)染色观察细胞线粒体:在荧光显微镜下随机选取5 个不重复区摄片，细胞系周围绿色的亮点即为摄取了Rh123 的线粒体。用ImageJ 软件分析5 个视野的绿色荧光强度平均值，再对每组的各样本进行统计分析。

1.3.3.5 LDH、MDA、SOD 的检测:分别吸取以上各组细胞培养上清液，严格按测试盒说明书测定LDH、MDA 水平与SOD 活性。

1.4 统计学分析

2 结果

2.1 木犀草素预处理对H2O2 损伤的心肌细胞存活力的影响

模型组A 值显著低于对照组(P＜0.01)，10 μmol/L以上木犀草素预处理组，显著回升(P＜0.01)，模型组与对照组差异具有显著性。而1 μmol/L的木犀草素预处理组A 值显著低于对照组(P＜0.01)，而木犀草素大、中剂量组对H2O2损伤的心肌细胞均有保护作用。因此，选用100 μmol/L木犀草素预处理组，作为接下去的实验组(表1)。

表1 心肌细胞MTT A 值及损伤抑制率Table 1 MTT A value of myocardial cells and inhibition rate of injury(±s，n=6)

表1 心肌细胞MTT A 值及损伤抑制率Table 1 MTT A value of myocardial cells and inhibition rate of injury(±s，n=6)

*P＜0.01 compared with control group;#P＜0.01 compared with model group．

groupA valueinhibiton rate(%)CON0.517 ±0.060 model0.377 ±0.036*LUT 200 μmol/L+ H2O20.618 ±0.017#156.98 LUT 100 μmol/L+ H2O20.515 ±0.054#98.88 LUT 50 μmol/L+ H2O20.509 ±0.035#95.53 LUT 10 μmol/L+ H2O20.521 ±0.039#102.23 LUT 1 μmol/L+ H2O20.395 ±0.026*31.84

2.2 不同处理因素心肌细胞形态变化结果

由显微镜下可见，正常培养组(图1A)的心肌细胞生长良好，细胞形态饱满，同步搏动有力，边缘清晰，分布均匀，相邻细胞伸出伪足偶联成簇;模型组(图1B)用1 mmol/L 的H2O2诱导后，细胞形态发生明显变化，皱缩变圆，伪足减少，细胞体积明显减小、瘦瘪，细胞间隙大，活性差，细胞搏动减少甚至无搏动，培养液中悬浮死细胞增多;而用木犀草素预处理后(图1C)的细胞生长情况良好，与对照组相似。由此表明木犀草素预处理后对H2O2损伤的心肌细胞具有保护作用。

2.3 心肌细胞搏动频率的测定结果

模型组心跳显著低于对照组(P＜0.01)，木犀草素预处理组搏动频率回升(P＜0.01)(表2)。

表2 心肌细胞跳动频率Table 2 Cardiomyocyte beating frequency(±s，n=8)

表2 心肌细胞跳动频率Table 2 Cardiomyocyte beating frequency(±s，n=8)

*P＜0.01 compared with control group;#P＜0.01 compared with model group．

groupfrequency (times/min)CON100 ±9 model64 ±6*LUT 100 μmol/L+1 mmol/L H2O296 ±8#

2.4 Hoechst 33342-PI 双染色后细胞形态学观察［5］

用Hoechst33342-PI 双染后，观察细胞形态学变化来评估细胞凋亡情况。33342-PI 荧光染色显示，正常培养组细胞系呈均匀蓝色，少见核碎裂、核浓染(图2A)，几乎没有细胞坏死(图2B);而模型组细胞存活明显减少，致密浓染核增多，核碎裂明显多于对照组(图2C)，坏死细胞也明显增加(图2D);木犀草素预处理组与对照组类似(图E/F)。

2.5 线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential，MMP)的测定［6］

图1 显微镜下观察不同组心肌细胞形态学的变化Fig 1 Different groups under the microscope morphological changes of myocardial cells(×200)

Rh123 是一种能够被线粒体所吸收的荧光染料，线粒体对其摄取能力取决于其跨膜电位，摄取能力越强，跨膜电位越大。根据荧光强度可以间接反映MMP 的高低。因此结果显示，对照组(图3A)活细胞数量多，形态良好，线粒体功能良好，荧光显示充足;而模型组(图3B)染料在线粒体内聚集的少，细胞形态不规则，荧光显示储存不良;木犀草素预处理组(图3C)与对照组结果相似。从表3 可知，模型组荧光强度显著低于对照组(P＜0.01)，木犀草素预处理组，与对照组无差异，与模型组相比差异具有显著性(P＜0.01)。模型组与对照组差异具有显著性，说明H2O2损伤模型成立，模型组心肌细胞可使线粒体对Rh123 的摄取能力明显降低，表明MMP 下降。木犀草素预处理后可以使线粒体对Rh123 的摄取能力明显提高，提示木犀草素能保护心肌细胞对抗H2O2对MMP的抑制作用，对细胞存在良好的保护作用。

表3 荧光染料罗丹明123(Rh123)染色后荧光强度测量Table 3 Cardiomyocyte beating frequency(±s，n=6)

表3 荧光染料罗丹明123(Rh123)染色后荧光强度测量Table 3 Cardiomyocyte beating frequency(±s，n=6)

*P＜0.01 compared with control group;#P＜0.01 compared with model group．

groupfluorescence intensity CON13.48 ±0.32 model11.29 ±0.51*LUT 100 μmol/L+1 mmol/L H2O213.99 ±0.44#

2.6 木犀草素对H2O2 损伤心肌细胞LDH、SOD及MDA 的影响

表4 可知，模型组LDH 和MDA 值显著高于对照组(P＜0.01)，而SOD 值显著低于对照组(P＜0.01)，木犀草素预处理组，与对照组无差异。模型组与对照组差异具有显著性，说明H2O2损伤模型成立，木犀草素预处理组可减少H2O2损伤后LDH 从细胞内的漏出量，使细胞内SOD 含量增加，使MDA 生成量减少，与模型组相比差异具有显著性(P＜0.01)。以上结果表明，木犀草素预处理后对H2O2诱导的乳鼠心肌细胞氧化损伤具有保护作用。

表4 木犀草素对H2O2损伤心肌细胞LDH、SOD和MDA 的影响Table 4 Affect of luteolin about LDH，SOD and MDA on myocardial cells injured by H2O2(±s，n=8)

表4 木犀草素对H2O2损伤心肌细胞LDH、SOD和MDA 的影响Table 4 Affect of luteolin about LDH，SOD and MDA on myocardial cells injured by H2O2(±s，n=8)

*P＜0.01 compared with control group;#P＜0.01 compared with model group．

groupLDH(U/L)SOD(U/L) MDA(nmol/L)CON5.37 ±0.3344.47 ±0.980.34 ±0.03 model16.12 ±0.45* 23.59 ±0.66* 0.83 ±0.04*LUT 100 μmol/L±1 mmol/L H2O2 5.39 ±0.32# 43.40 ±1.19# 0.32 ±0.03#

3 讨论

凋亡是细胞在基因调控下的主动性死亡，心肌细胞凋亡可导致心脏功能发生退行性改变，因此在心脏疾病发生过程中，凋亡的发生是不可避免的，如果对凋亡过程进行适当干预则可保护心肌功能，心脏疾病的发展势必会缓慢下来。细胞凋亡与氧化应激密切相关，氧化应激时细胞产生大量活性氧自由基，损伤细胞DNA，诱导细胞发生凋亡。H2O2是体内氧化代谢的产物，它不仅能直接氧化细胞膜上的脂质及蛋白，而且能自由穿过细胞膜和细胞内的铁离子反应生成OH 等活性更强的自由基，导致一系列反应。离体实验中，H2O2损伤可模拟体内多种心脏疾病的病理状态，如心肌细胞缺血缺氧等病理过程，其损伤模型是常见的研究缺血性心脏病的实验模型之一。

木犀草素是一种天然黄酮类化合物，存在于多种植物中，如中药野菊花、金银花、紫苏等中含量较高。其具有多种药理活性，如保护心血管［7］、抗氧化［8］、抗炎［9］、抑制凋亡［10］、舒张血管［11］等多种生物学作用，其不良反应低，具有良好的临床应用潜力。

本实验在细胞水平上证明木犀草素对H2O2诱导损伤造成的缺血缺氧的乳鼠心肌细胞具有保护作用，结果提示木犀草素的作用机制与提高心肌细胞活力，稳定心肌细胞膜、增强细胞抗氧化损伤能力，减少脂质过氧化物导致的细胞膜损伤，抑制细胞凋亡及坏死，保护心肌细胞线粒体膜电位及功能等因素有关。由于本实验所用化合物是由浙江天草生物制品有限公司从花生壳中提取出来的，说明花生壳中含有具有生物活性的化学成分，具有一定的开发价值，可以拓展花生资源的综合开发利用。当然由于中药野菊花、金银花、紫苏等中木犀草素含量较高，如果用木犀草素预处理后对过氧化氢所诱导的心肌细胞损伤具有较好的保护作用，那么像金银花、野菊花等泡茶是否具有心脏保护作用就可以进一步的研究了，也为预防心脏疾病的发生提供一条新思路。

［1］杜贯涛，彭蕴茹，刘国卿．木犀草素对H2O2诱导乳鼠心肌细胞损伤的保护作用［J］．江苏中医药，2006，27:74－75．

［2］何玲，孙桂波，孙潇，等．木犀草苷对阿霉素诱导乳鼠心肌细胞损伤的保护作用［J］．中国药理学通报，2012，28:1229－1234．

［3］闫庆峰，闫高峰，李跃萍，等．木犀草素对冷保存心脏功能及心肌细胞凋亡的影响［J］．中国热带医学，2012，12:393－395．

［4］陈妍，王振远，郭秀侠，等．乳鼠心肌细胞的原代培养方法的改进［J］．中国生物制品学杂志，2006，19:520－521．

［5］李蕾，杨帆，匡志鹏，等．蛤蚧蛋白组分对肝癌HepG-2 细胞生长抑制作用的研究［J］．中国癌症防治杂志，2011，3:15－19．

［6］魏水生，廖新学，谭钰嫔，等．热休克蛋白90 在硫化氢抗化学性缺氧诱导心肌细胞氧化应激损伤中的作用［J］．中国病理生理学杂志，2009，25:2329－2333．

［7］杜贯涛，彭蕴茹，刘国卿．木犀草素对H2O2诱导乳鼠心肌细胞损伤的保护作用［J］．江苏中医药，2006，27:74－75．

［8］牟艳玲，胡志力，周玲，等．木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷对H2O2诱导乳鼠心肌细胞损伤的保护作用［J］．山东中医药大学学报，2009，33:63－65．

［9］张新娟，左国营，王涛，等．木犀草素与抗菌药体外联用抗耐甲氧西林金葡菌的作用研究［J］．药学进展，2012，36:173－179．

［10］闫庆峰，闫高峰，李跃萍，等．木犀草素对冷保存心脏功能及心肌细胞凋亡的影响［J］．中国热带医学，2012，12:393－395．

［11］章李军，凌霜，陈刚领，等．野菊花提取物舒张血管及抗炎机制研究［J］．上海中医药杂志．2009，43:60－63．