多齿红山茶籽多酚组分的抗氧活性研究

王进英 钟海雁 朱晓阳 周 波

（1．稻谷及副产物深加工国家工程实验室，湖南 长沙 410004；2．粮油深加工与品质控制湖南省重点实验室，湖南 长沙 410004；3．中南林业科技大学食品科学与工程学院，湖南 长沙 410004）

油茶（Camellia oleifera）是中国特有的食用油料树种之一。

关于油茶多酚提取的研究报告较多，包括溶剂提取方法［1］，乙醇提取和超声波辅助提取结合正交试验设计方法，BP人工神经网络分析方法相结合进行仿真模拟和优化对油茶籽饼多酚进行提取［2，3］以及响应面法对微波辅助提取［3－5］等。袁英姿等［4，6］分别研究了大孔吸附树脂纯化油茶籽多酚的方法和油茶籽多酚的抗氧化性，通过静态吸附与解吸试验，从5种树脂中筛选出D－3520为纯化油茶籽多酚理想的吸附树脂；抗氧化性研究表明单甘酯能将油茶籽多酚－茶油乳化分散成均匀的体系，有助于提高油茶籽多酚的抗氧化性，尤其是油茶籽多酚与抗坏血酸协同使用时，抗氧化效果优于BHT。毛方华等［7］研究表明，油茶籽毛油中的多酚类物质对羟基自由基及超氧阴离子自由基有良好的清除作用，加入多酚样品的浓度为0．53～7．29μg／mL 时，对羟基自由基的清除率达65．21%以上。陈虹霞等［8］从茶籽饼粕中提取黄酮苷类化合物，通过高效液相色谱制备收集并通过IR、MS和NMR 进行结构鉴定，结果表明两种化合物分别为山奈酚3－O－［2－O－β－D－半乳糖－6－O－α－L－鼠李糖］－β－D－葡萄糖苷和山奈酚3－O－［2－O－β－D－木糖－6－O－α－L－鼠李糖］－β－D－葡萄糖苷。

Takashi Yoshida等［9］从油茶中分离出1种新的二聚体鞣花单宁Camellioferin A 及13种已知的单宁类物质，包括Camellins A 和B，并通过光谱法对新物质的结构进行了鉴定。Daisuke Mukai等［10，11］从油茶叶中分离出5种新的单宁类物质，以驱虫药甲苯咪唑为阳性对照研究了它们对秀丽隐杆线虫的毒性，结果表明其中3种物质的LC50值小于甲苯咪唑，因此很多油茶多酚类物质可能具有杀虫作用。

如上所述，国内外工作者对油茶多酚的提取、纯化及功能活性作用等已进行了某些方面的研究，但相关报道总体还不是太多，特别是中国国内对油茶多酚结构鉴定与生物学活性及其机理研究方面还有待深入。

本试验以多齿红山茶茶籽为研究对象，采用DPPH 法和ABTS法对半制备色谱分离出的多齿红山茶茶籽多酚类物质进行测定，评价其体外抗氧化能力，以期为油茶多酚物质的利用提供一定的理论支持和参考数据。

1 材料与方法

1．1 材料及处理

多齿红山茶（Camellia polyodonta how）：山茶科山茶属，茶籽采于长沙市中南林科大校园。油茶籽多酚的提取：将油茶籽去壳，称取40g，研磨，采用600 mL 60%的甲醇作为溶剂，在功率为800 W 的微波炉中提取60s，过400目筛后，400r／min离心10min，取上清液，旋转蒸发回收溶剂。

1．2 试剂与仪器设备

DPPH·、ABTS＋、L－抗坏血酸（VC）、生育酚：美国Sigma公司；

过硫酸钾（K2S2O8）：99%，天津市大茂化学试剂厂；

甲醇、无水乙醇：分析纯，天津市大茂化学试剂厂；

紫外分光光度计：UV－1800型，日本岛津公司；

超低温冰箱：DW－86L628型，海尔公司。

1．3 试验方法

1．3．1 样品清除DPPH·自由基能力的测定 用甲醇溶解DPPH·粉末，配制成6mmol／L 的储备液，－20 ℃保存，临用前用甲醇稀释至60μmol／L。根据清除DPPH·自由基预试验的结果，为了使测定的吸光度在合适的范围内，L－抗坏血酸 配 制 成 浓 度 为113．56～681．35 μmol／L，即20～120μg／mL的水溶液，将分离得到的10种组分样品用50%乙醇水溶液分别配制成浓度为20～8 000μg／mL 的溶液，取0．4mL样品或L－抗坏血酸溶液和2．4 mL DPPH·溶液在室温下混合均匀，置于暗处反应30min，在515nm 波长下读取吸光度。L－抗坏血酸用作阳性对照，同时设空白阴性对照。清除活性用半数有效浓度（EC50）表示。依据式（1）计算清除率。

式中：

R—— 清除率，%；

A空白—— 空白对照的吸光度；

A样品—— 加入样品反应后的吸光度。

1．3．2 样品清除ABTS·＋自由基能力的测定 将5 mL 7mmol／L 的ABTS·＋水溶液和88μL 140mmol／L的高硫酸钾混合，在室温下避光还原12～16h后，得到ABTS·＋自由基储备液。该储备液在室温、避光的条件下稳定。

ABTS·＋储备液在使用前用无水乙醇稀释，直至在分光光度计上于734nm 波长处测定到吸光度为0．51±0．02。根据清除ABTS·＋自由基预试验的结果，为了使测定的吸光度在合适的范围内，生育酚用50%乙醇水溶液配制成浓度为20～120μmol／L，即5～30μg／mL的溶液，样品分别用同样的乙醇水溶液配制成浓度为2．5～6 000μg／mL 的溶液，取0．4mL样品或生育酚溶液和2．4mL ABTS·＋溶液在室温下混合10s，置于暗处6 min，在734nm 波长下读取吸光度。生育酚用作阳性对照，同时设空白阴性对照。清除活性用半数有效浓度（EC50）表示。依据式（1）计算清除率。

2 结果与分析

2．1 各组分清除DPPH·自由基的能力

由表1可知，10种组分的浓度均与DPPH·自由基清除能力成正比例变化，相关系数R2在0．858 7～0．994 6，说明组分浓度和DPPH·自由基清除能力具有良好的量效关系。10种组分和L－抗坏血酸的DPPH·自由基清除能力大小为L－抗坏血酸＞组分2＞组分3＞组分8＞组分5＞组分9＞组分1＞组分4＞组分6＞组分7＞组分10。10 种组分的DPPH·自由基清除能力均低于L－抗坏血酸。

表1 L－抗坏血酸和10种组分的线性回归方程与半数有效浓度（EC50）Table1 Linear regression equation and EC50of Vitamin C and 10fractions

2．2 组分清除ABTS·＋ 自由基的能力

由表2可知，10种组分的浓度均与ABTS·＋自由基清除能力成正比例变化，相关系数R2在0．839 8～0．996 8，结果说明组分浓度和ABTS·＋自由基清除能力具有良好的量效关系。10种组分和生育酚的ABTS·＋自由基清除能力大小为组分3＞生育酚＞组分2＞组分8＞组分5＞组分4＞组分1＞组分9＞组分6＞组分7＞组分10。组分3 对ABTS·＋自由基的清除能力强于生育酚，其它9 种组分的清除能力低于生育酚。

表2 生育酚和10种组分的线性回归方程与半数有效浓度（EC50）Table2 Linear regression equation and EC50of Trolox and 10fractions

3 结论

本试验主要通过DPPH 法和ABTS法这两种体外抗氧化能力的评价方法研究了半制备色谱分离收集的多齿红山茶茶籽多酚类物质的抗氧化活性。

在试验浓度范围内，10种组分的浓度与DPPH·自由基和ABTS·＋自由基清除能力成正比例变化，曲线的相关系数R2均在0．858 7～0．994 6，组分浓度与DPPH·自由基和ABTS·＋自由基的清除能力具有良好的量效关系。10种组分和L－抗坏血酸的DPPH·自由基清除能力大小为L－抗坏血酸＞组分2＞组分3＞组分8＞组分5＞组分9＞组分1＞组分4＞组分6＞组分7＞组分10。10种组分的DPPH·自由基清除能力均低于L－抗坏血酸。10 种组分和生育酚的ABTS·＋自由基清除能力大小为组分3＞生育酚＞组分2＞组分8＞组分5＞组分4＞组分1＞组分9＞组分6＞组分7＞组分10。组分3对ABTS·＋自由基的清除能力强于生育酚，其它9种组分的清除能力低于生育酚。

体外抗氧化能力的测定结果并不是很理想，多数组分的抗氧化能力低于标准样品，有一部分组分的抗氧化能力与标准样品接近，只有组分3的ABTS·＋自由基清除能力明显强于生育酚。但由于使用的试验方法只有两种，结果并不全面，有待今后使用更多的抗氧化能力评价方法对茶籽多酚进行研究。

1 曾献，袁英姿，曹清明，等．油茶籽多酚的提取研究［J］．食品与机械，2008，24（4）：69～72．

2 王徐卿，沈建福，王敏，等．油茶籽饼多酚的乙醇提取工艺优化研究［J］．浙江林业科技，2007，27（3）：41～44．

3 王徐卿，沈建福，王敏，等．超声波辅助提取油茶籽饼多酚类物质工艺的研究［J］．食品科技，2007（9）：238～241．

4 吕杰，钟海雁，袁英姿，等．油茶籽多酚微波辅助提取响应面法的优化［J］．经济林研究，2010，28（3）：40～44．

5 袁英姿，曹清明，钟海雁，等．大孔吸附树脂纯化油茶籽多酚的研究［J］．食品与机械，2009，25（1）：61～63，85．

6 袁英姿，曹清明，钟海雁，等．油茶籽多酚对茶油的抗氧化性的研究［J］．食品工业科技，2009，30（6）：103～105．

7 毛方华，王鸿飞，林燕，等．油茶籽毛油中多酚类物质对自由基的清除作用［J］．中国粮油学报，2010，25（1）：64～68．

8 陈虹霞，王成章，叶建中，等．油茶饼粕中黄酮苷类化合物的分离与结构鉴定［J］．林产化学与工业，2011，31（1）：13～16．

9 Yoshida T，Nakazawa T，Hatano T，et al．A dimeric hydrolysable tannin fromCamellia oleifera［J］．Phytochemistry，1994，37（1）：241～244．

10 Daisuke Mukai，Noriko Matsuda，Yu Yoshioka，et al．Potential anthelmintics：polyphenols from the tea plant Camellia sinensis L．are lethally toxic to Caenorhabditis elegans ［J］．J．Nat Med．，2008（62）：155～159．

11 Chaovanalikit A，Wrolstad R E．Total anthocyanins and total phenolics of fresh and processed cherries and their antioxidant properties［J］．Food Chemistry and Toxicology，2004，69（1）：67～72．