浓香型大曲糖化动力学研究

任 飞 张晓宇

（1.西南科技大学食品科学与技术研究所，四川 绵阳 621010；2.江南大学食品学院，江苏 无锡 214122）

以泸州老窖为代表的浓香型大曲酒是以己酸乙酯为主体香味成分，其风格特征：窖香浓郁，绵甜爽净，回味悠长［1］。几十年来，浓香型大曲酒深受广大消费者的喜爱。浓香型大曲含有多种微生物产生的多种酶类，是浓香型大曲酒生产的糖化剂、发酵剂和生香剂，其品质对曲酒的出酒率和酒质都有很大的影响，所以有“曲是酒之骨”的说法［2］。浓香型大曲酒的酿造是在中温（或中温偏高温）大曲的作用下，进行“双边”发酵——边糖化边发酵。在大曲酒的发酵过程中，浓香型大曲的作用如下：①为大曲酒的入窖糟醅中原料的分解提供酶类：液化酶类、糖化酶类、蛋白酶类、脂肪酶类，等等；②为大曲酒的发酵提供主要菌种来源，如霉菌、酵母菌、细菌等；③是大曲酒中一些香味物质及香味前体物质的来源；④大曲中淀粉含量高达57%左右，可以为大曲酒的发酵提供一部分发酵原料［3］。浓香型大曲中的糖化酶类主要源于微生物在制曲过程中新陈代谢作用，糖化酶类在大曲酒生产的边糖化边发酵过程中起着重要作用。在本试验中通过测定大曲的糖化酶类的糖化动力学，研究不同反应条件（底物浓度、酶用量、温度、pH）对大曲糖化反应速率的影响，为浓香型大曲酒的生产工艺控制提供理论的参数。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

大曲：来自于四川浓香型大曲酒生产厂家。

乙酸钠、乙酸、硫酸铜、酒石酸钾钠、亚铁氰化钾、氢氧化钠、葡萄糖、浓盐酸、磷酸氢二钠、柠檬酸：均为分析纯，国药集团上海化学试剂有限公司。

试验用水：均为纯净水。

1.2 仪器与设备

数字酸度计：PHS－25，上海雷磁仪器厂；

电子分析天平：BSA124S，德国Sartorius公司；

电热恒温鼓风干燥箱：DGF3006A，重庆银河试验仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 可溶性淀粉溶液的制备 准确称取可溶性淀粉，加少量水调匀，加入沸水中，继续煮沸至透明，冷却后用水定容，制得试验所需的淀粉溶液。使用时根据需要稀释成不同浓度的淀粉溶液。

1.3.2 5%大曲浸出液的制备 5.0g大曲（以绝干曲计），加入90mL水和10mL乙酸－乙酸钠缓冲溶液，搅匀，于30 ℃水浴中保温浸取1h，每隔15min搅拌1次。用脱脂棉过滤，滤液为5%大曲浸出液（酶液），取上清液置于冰水浴中待用。使用前5min将所需量的大曲浸出液取出，装入干净的试管中置于糖化反应所需温度的水浴中，使其达到需要的温度。

1.3.3 缓冲液的制备 为了测定pH 值对大曲糖化力的影响，需配制pH 值为3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0的磷酸氢二钠－柠檬酸缓冲液［4］。

1.3.4 还原糖含量的测定 斐林试剂法［5］。

1.3.5 糖化反应速率的计算 因为在中温发酵时，反应温度常控制在30 ℃左右。在本试验中，除研究温度对酶反应的影响外，反应温度均控制在30 ℃。根据要求改变底物（可溶性淀粉）浓度、酶浓度（酶液用量）、糖化反应的pH 值、反应温度，进行试验，糖化反应时间均为5 min，糖化反应结束时用0.1mol／L的NaOH（注：测定pH 对糖化反应速率的影响时用0.2mol／L的NaOH）溶液15 mL 终止反应，定容至50mL，取5mL反应液用斐林试剂法测定反应液中还原糖的含量。同时做空白对照，糖化反应速率按式（1）计算：

式中：

V—— 糖化反应速率，mg／（mL·min）；

V1——5mL 糖化液消耗0.1% 葡萄糖标准溶液的体积，mL；

V0—— 空白对照消耗的消耗的0.1% 标准葡萄糖溶液的体积，mL；

C —— 标准葡萄糖溶液的浓度，mg／mL。

2 结果与讨论

2.1 底物浓度对大曲糖化速率的影响

以不同浓度的可溶性淀粉作为底物，大曲浸出液用量5mL，反应温度30 ℃，准确反应5 min后，加入0.1 mol／L的NaOH 溶液15mL，终止反应，定容至50 mL。研究底物浓度变化对大曲糖化反应初速率的影响，试验结果见图1。

图1 底物浓度对糖化反应速率的影响Figure 1 Effect of substrate on initial rate of saccharification

大曲糖化反应是大曲中含有的多种糖化酶共同参与的结果。由图1可知，反应速率V 对［S］呈典型的双曲线关系符合经典的表征酶促反应特征的米氏方程的曲线形状。因此，可将本试验测得的数据与米氏方程进行拟合，用Excel 2003软件进行数据处理，以1／V ～1／［S］作图，得到如图2所示的直线。由回归方程：

可 求 出Vmax＝0.148 0 mg／（mL· min），Km＝25.935 7mg／mL，所以大曲糖化反应的动力学方程为

图2 Lineweaver－Burk双倒数作图法Figure 2 Lineweaver－Burk plot of initial rate of saccharification with substrate concentration

2.2 酶用量对反应速率的影响

底物浓度为15mg／mL，反应温度为30 ℃，pH 为4.6，糖化酶用量对大曲糖化反应速率的影响见图3。由图3 可知，酶用量与糖化反应速率呈线性关系。当底物浓度比酶浓度大很多，即［S］＞＞［E］，因此被酶结合的S 量，亦即［ES］，它与总的底物浓度相比，可以忽略不计。根据酶反应的中间复合物学说［6］得出式（4）：

上述两步反应都是可逆的，它们的正反应与逆反应的速率常数分别为k1、k2、k3、k4，可以推导得出：

图3 酶用量对糖化速率的影响Figure 3 Effect of enzyme concentration on initial rate of saccharification

式（5）表明酶反应体系中反应速率V 与酶浓度［E］呈正比，与试验结果相符。

在浓香型大曲酒的生产中，可以通过大曲的用量来控制糖化反应速率，夏季气温较高，要使大曲酒的发酵过程符合“前缓、中挺、后缓落”，必须减少用曲量，一般情况下，夏季的用曲量为投粮量的18%，冬季用曲量为投粮量的21%［6，7］。

2.3 pH 对糖化速率的影响

底物浓度为15mg／mL，糖化反应的温度为30 ℃，酶用量为5mL，利用5mL磷酸氢二钠－柠檬酸缓冲液调剂反应体系的pH 值，研究在不同的pH 条件下大曲糖化反应速率，反应结束时，用0.2mol／L 的NaOH 溶液终止反应，试验结果见图4。由图4可知，当pH 值在3.0～6.0时，糖化反应速率随pH 值的升高而逐渐增加；当pH 值在6.0～8.0时，糖化反应速率随pH 的升高而逐渐降低；因此，浓香型大曲糖化酶的最适pH 为6.0。

图4 pH 对大曲糖化反应速率的影响Figure 4 Effect of pH on the initial rate of saccharification

在酿造浓香型大曲酒的过程中，控制入窖糟醅的pH 可以控制糖化反应的速率，有利影响有3个方面：①过酸或过碱可导致酶活性的丧失，空间结构被破坏；②当pH 值的改变不太剧烈时，酶虽未变性，活力可能受到影响；③pH 可影响维持酶分子的空间结构有关基团的解离，进而影响酶活性部位的构象，酶的活性可能受到影响［8］。

由图4可知，大曲糖化反应速率与pH 呈钟罩形曲线，表明pH 对大曲中糖化酶类的糖化反应的影响与对单一糖化酶的影响类似。“双边发酵”顺利地进行，可以提高大曲酒的质量和产量。

2.4 温度对大曲糖化速率的影响

温度是影响酶活性的重要因素，研究酶的最适温度，在工业生产中有重要的意义［9］。底物浓度为15 mg／mL，pH为4.6，酶液用量为5mL，在不同的温度条件下测定大曲的糖化反应速率，温度对大曲糖化反应速率的影响见图5。

由图5可知，在10～50 ℃时，大曲的糖化反应速率随着温度的升高而增加。这是因为当温度升高时，酶催化反应与一般化学反应一样，反应速率加快［8］。在通常情况下，窖池内糟醅的发酵温度最高不会超过40 ℃。在这一温度范围之内，大曲的糖化反应速率随着温度的升高而增加。酵母菌在高温下过早衰亡，使得发酵无法彻底地进行下去，到发酵中期，发酵相当微弱，所以导致了出酒率的下降［6］。浓香型大曲酒传统的入窖温度是“热平地温冷13 ℃”，也就是控制较低的温度入窖发酵，控制“低温缓慢发酵”，做到“前缓、中挺、后缓落”。夏季气温较高应调整作息时间，利用气温较低的夜间和早晨进行生产，尽量避免在气温较高的中午进行生产，来减慢糖化反应的速率［10，11］。由表1可知，温度对大曲糖化反应速率有较大的影响，浓香型大曲糖化反应速率是温度的函数。

图5 温度对大曲糖化反应初速率的影响Figure 5 Effect of temperature on the initial rate of saccharification

表1 不同温度下的糖化反应速度Table 1 Initial rate of saccharification in different temperature

将表1中的试验数据，以lnV－1／T 作图，可得如图6所示的直线，R2＝0.988 1，说明用阿仑尼乌斯方程拟合本试验数据是高度显著的，表明糖化反应速度随温度的变化服从阿累尼乌斯（Arrhenius）方程：

式中：

A—— 指前因子；

E—— 活化能，J／mol；

R—— 通用气体常数，8.314J／（mol·K）；

T—— 开氏温度，K。

可求出：指前因子A ＝6.21×105mg／（mL·min），活化能E ＝40.966kJ／mol；与钟穗生等［12］报道的马铃薯淀粉糖化反应的活化能E ＝41.165kJ／mol比较接近。

图6 lnv 与1 000／T 的关系图Figure 6 Relationship of lnv with 1 000／T

3 结论

浓香型大曲作为浓香型大曲酒生产的糖化发酵剂，含有由多种微生物产生的多种糖化酶。用5%浓香型大曲浸出液水解可溶性淀粉，在pH 4.6、30 ℃的条件下，浓香型大曲糖化酶的米氏方程为V ＝0.148 0［S］／（25.935 75＋［S］）；糖化反应的最适pH 值为6.0；在不同温度下测定糖化反应速率，计算得到活化能E 为40.966kJ／mol。浓香型大曲糖化酶类的糖化反应动力学与单一酶相似，这可能是因为酶具有专一性，以淀粉为底物时，只有糖化酶类起作用。通过控制淀粉浓度（投粮量）、用曲量、入窖酸度和温度可以使浓香型大曲酒的糖化、发酵过程协调进行，以提高浓香型大曲酒的产量和质量。

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11 李大和，李国红.浓香型曲酒酿造生产工艺要素（四）［J］.酿酒，2011，38（1）：81～87.

12 钟穗生，刘生玉，张林香.马铃薯淀粉糖化动力学的研究［J］.中国粮油学报，1998，13（2）：21～25.