柑橘中β－葡萄糖苷酶的研究进展

何芒芒，张 芸，任婧楠，王可兴，潘思轶，范 刚

( 环境食品学教育部重点实验室，华中农业大学食品科技学院，湖北武汉430070)

β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase)又称β-D 葡萄糖苷水解酶。它包括一个异构组的酶，能够水解双糖或者低聚糖的β-葡萄糖苷键以及其它的葡萄糖共轭键，从而释放出糖苷及其配基［1］。β-葡萄糖苷酶广泛地分布于自然界中，并且在许多的生命过程中都扮演着关键的角色。其中包括香气的释放，生物体内激素的激活，发芽过程中细胞壁寡糖的降解，纤维素生物质的降解，糖脂的水解，生氰作用，以及次级代谢产物的改造等过程。在植物体中，β-葡萄糖苷酶的活性伴随在一些进程中，比如激素的激活，对于病原体，微生物，昆虫，寄生植物以及食草动物的防御机制，花的发育和色素沉着等。β-葡萄糖苷酶还被认为在细胞壁降解的过程中起到一定的作用。一些植物来源的β-葡萄糖苷酶具有高度的底物专一性，按照其对底物的特异性还可以大致将其分为3 类:第一类是只能水解烃基-β-葡萄糖苷的酶，这类β-葡萄糖苷酶能够水解纤维二糖等;第二类是只能水解芳香基-β-葡萄糖苷的酶，这类酶能水解对硝基苯-β-D-葡萄糖苷等类似物;第三类是能够水解烃基-β-葡萄糖苷或芳香基-β-葡萄糖苷的酶，此类β-葡萄糖苷酶能水解纤维二糖、对硝基苯-β-D-葡萄糖苷等［2-3］。在过去的二十年中，β-葡萄糖苷酶受到了人们大量的关注，主要是因为它在食物排毒，生物质转化以及酒和饮料的增香等领域的应用。除此之外，β-葡萄糖苷酶还可以用于各种糖苷的合成，这些糖苷在食品，化妆品，制药以及洗涤剂等领域有着很高的商业价值。例如:烷基糖苷因具有良好的表面活性剂性能、低毒性以及良好的生物降解性，已成为一种最具前景的非离子型表面活性剂。此外，许多糖苷还具有抗氧化、降低血糖水平、保护膜不受冷冻的侵害以及抑制酪氨酸酶等生物活性。目前，国内外的研究学者已经对各种来源的β-葡萄糖苷酶的提取、纯化及酶学性质进行了大量的研究。但是，对于柑橘中的β-葡萄糖苷酶的研究还比较少。并且，内源糖苷水解酶在糖苷香气前体体内形成与水解释放中的作用及其影响因素也少见报道。柑橘的果实中也含有β-葡萄糖苷酶。最值得关注的是β-葡萄糖苷酶与柑橘果实的香气有着一定的联系。国内外研究学者发现，糖苷类香气前体的水解释放可以显著地增强水果及其加工制品的整体香气品质，是增强及保持水果及其加工制品良好香气品质的有效方法之一。而β-葡萄糖苷酶是糖苷类香气前体水解释放的关键酶［4-6］。因此，对于柑橘中β-葡萄糖苷酶的研究可以为柑橘果实香气的形成机理、增香调控、提高柑橘加工制品的品质等提供理论指导。

1 柑橘中β-葡萄糖苷酶的酶活测定以及分离纯化方法

柑橘的果皮、果汁以及果肉中都存在β-葡萄糖苷酶。由于柑橘的不同组织部位的形态及理化性质不同，以及各个组织部位中β-葡糖糖苷酶含量也不同，因此，柑橘不同组织部位中β-葡萄糖苷酶的活性也是不同的。Burns 和Baldwin 研究发现葡萄柚白皮层中β-葡萄糖苷酶活性最高，其次为果皮，而果汁中的活性最低［7］。Barbagallo 等研究也发现血橙果肉中β-葡糖糖苷酶的酶活高于离心果汁中的酶活，他们由此得出结论，柑橘中的β-葡糖糖苷酶主要与固态部分结合紧密，有可能与果胶结合在一起［8］。

1.1 柑橘中β-葡萄糖苷酶的基本性质［8-13］

目前有关柑橘中β-葡萄糖苷酶酶学性质的研究很少，只有血橙和瓦伦西亚甜橙中的β-葡萄糖苷酶的相关研究报道。

血橙(Citrus sinensis(L)Osbeck Tarocco)粗汁中β-葡萄糖苷酶的酶活约为1.5 ×10-3U/g，被检出的分子量为55、65ku，Km 值为0.267mmol/L，最适pH为4.5，最适反应温度为60℃，75℃时的D 值为3min，Z 值为9.5℃，具有良好的热稳定性，其在血橙成熟过程中酶活呈现上升趋势，然后降低，此外，葡萄糖对其活性具有明显的抑制作用，但是果糖和乙醇对其活性没有影响［8］。

瓦伦西亚甜橙(Citrus sinensis var.Valencia)中的β-葡萄糖苷酶经Superdex 凝胶过滤层析处理后的酶活为11ku，经Toyopearl HW-55S 凝胶过滤层析处理后测得的酶活为24.5ku，而再经BioGel P-100 柱纯化后测得的酶活则为55ku。该品种柑橘中β-葡萄糖苷酶的最适pH 为4.5～5.5，在pH5.0 时的最适反应温度为40～45℃，Km 值为0.1146mmol/L［4］。

此外，Burns 曾对瓦伦西亚甜橙汁中的糖苷酶在贮藏过程中的变化进行了研究，并发现α-半乳糖苷酶酶活在8 周的贮藏期中稳定，而β-半乳糖苷酶酶活在这一阶段下降了;经离子交换和凝胶过滤层析纯化后，他们发现瓦伦西亚橙汁中的α-和β-半乳糖苷酶分别有两种异构体，其Km 值分别为0.47(α-半乳糖苷酶Ⅰ)、0.23(α-半乳糖苷酶Ⅱ)、0.27(β-半乳糖苷酶Ⅰ)和0.77(β-半乳糖苷酶Ⅱ)mmol/L［9］。Burns 和 Baldwin 对葡萄柚(Citrus paradisi Macf.cv.Ruby Red)果皮、白皮层及果汁中的其他糖苷酶在成熟过程中的变化进行了研究，但并未对其酶学性质进行测定，他们发现葡萄柚果皮中的β-半乳糖苷酶酶活在9 月份最高，然后急剧下降，直到11 月份后无明显变化，果皮中的α-半乳糖苷酶酶活很低，且在葡萄柚成熟过程中无明显变化，而果皮中的α-甘露糖苷酶酶活在采摘初期酶活很低，随着果实的成熟，其酶活稳步提高;葡萄柚白皮层中的这些糖苷酶的酶活变化规律与果皮中的差别不大;而果汁中的β-半乳糖苷酶酶活在整个成熟期变化不大，果汁中的α-半乳糖苷酶和α-甘露糖苷酶酶活在初期采收后酶活分别降低了70%和50%［7］。

1.2 柑橘的不同部位粗酶液的制备方法

柑橘皮中β-葡萄糖苷酶粗酶液的制备方法为:将柑橘皮用一定量的柠檬酸-磷酸缓冲液(pH6.0)，冰浴上充分研磨成匀浆，加缓冲液于4℃下浸提60min，然后于10000 × g 冷冻离心15min，然后取上清液用相应的缓冲液定容得粗酶液。

柑橘果汁中β-葡萄糖苷酶粗酶液的制备方法为:将柑橘去皮榨汁后直接于20000 × g 冷冻离心30min，上清液可直接测定酶活。所得的沉淀物用一定量的柠檬酸-磷酸缓冲液(pH6.0)于4℃浸提60min，然后于10000 × g 冷冻离心15min，取上清液用相应的缓冲液定容得粗酶液。

1.3 柑橘中β-葡萄糖苷酶酶活的测定方法

柑橘中β-葡萄糖苷酶酶活的测定方法主要有三种，第一种是光谱法，该法是根据柑橘中β-葡萄糖苷酶在一定的温度和时间条件下可以催化底物p-NPG，生成对硝基苯酚。对硝基苯酚在碱性条件下于402nm 左右处有最大吸收峰，因此，可以以p-NPG为底物通过反应产物的显色来检测酶活。具体的方法为，在试管中加入一定量的粗酶液，然后加入10mmol/L 的p-NPG，在一定的温度下反应一段时间后加入1mol/L 的Na2CO3终止反应。然后在402nm 左右测吸光度，再根据对硝基苯酚标准曲线计算出酶活［4，8，10］。第二种方法是通过测定释放出的葡萄糖的含量来计算β-葡萄糖苷酶的酶活。根据β-葡萄糖苷酶能够水解β-低聚糖或者β-葡萄糖苷释放出葡萄糖，释放出的葡萄糖再采用离子交换色谱脉冲安培检测器(HPAEC-PAD)进行检测，响应值和糖浓度呈正相关关系，并以2-去氧半乳糖为内标物确定释放出的糖含量，从而可计算出β-葡萄糖苷酶的酶活。第三种方法是通过测定释放出的柑橘中的酚类物质来计算β-葡萄糖苷酶的酶活。具体操作是将β-葡萄糖苷酶和一定浓度的橙皮素二氢查耳酮葡萄糖苷、橙皮素-7-O-葡糖苷等糖苷在40℃条件下反应2h，然后浸入沸水浴中保持5min 以终止反应，再采用高效液相色谱法测定释放出的酚类物质的含量，从而确定β-葡萄糖苷酶的酶活［4］。

1.4 柑橘中β-葡糖糖苷酶的分离和纯化方法

由于不同来源的β-葡萄糖苷酶性质差异很大，因此，一般没有适合各种不同体系中的β-葡萄糖苷酶的分离纯化的固定方法。但所有分离纯化方法的关键步骤、基本手段还是基本一致的。一般来说，分离的第一步是将细胞破碎，使内含物从细胞中释放出来。第二步就是制备粗酶液，然后就可以采用几种溶解度分级法进行初步分离，再进一步纯化。

一般采用多种离子交换层析结合的方法来进行分离纯化柑橘中的β-葡萄糖苷酶。首先由柑橘果实制备粗酶液，然后使用硫酸氨(80%饱和度)沉淀，再用聚丙烯酰胺凝胶(12%)进行电泳纯化分析［8］;或者粗酶液分别经过DEAE Sephacel、CM-Sepharose及凝胶过滤层析等多步纯化在进行分析［4］。

2 柑橘中β-葡萄糖苷酶对柑橘果实香气的影响

香气是影响柑橘果实以及其加工制品品质的最重要因素之一，研究柑橘的香气组成，对于防止柑橘加工过程中香气物质的损失、保持柑橘加工制品的特征香气、提高其总体香气品质具有非常重要的意义。柑橘的香气主要由酯类、醛类、萜烯类化合物等构成，其中萜烯类化合物是柑橘果实香气中含量最高的一类香气物质，由于这类物质具有弱极性，所以它们更容易存在于果肉中。除游离态香气物质外，柑橘中还存在一类不具挥发性，与柑橘果实中的糖类物质通过糖苷键结合，以糖苷的形式存在的香气前体物质，即糖苷键合态香气物质(glycosidically bound aroma compounds)［11］。

目前，有关柑橘中β-葡萄糖苷水解酶对其香气品质影响的研究鲜有报道，但外源β-葡萄糖苷酶对柑橘中键合态香气物质的水解释放具有明显的作用。Gueguen 等［12］研究发现，在橙汁中添加β-葡萄糖苷酶能够明显地增加芳樟醇、苯甲醇和苯乙醇的含量。宛晓春等［13］采用Amberlite XAD-2 树脂吸附洗脱的方法对柠檬汁中的键合态萜类化合物进行了分离，并应用β-葡萄糖苷酶对其进行了水解释放，共检出9 种键合态香气物质。孙爱东等［14］对甜橙中分离得到的的键合态香气物质进行了β-葡萄糖苷酶酶解释放，共发现8 种物质，且酶解后的橙汁风味典型温和。孙爱东等［15］又比较了不同来源的增香酶酶解橙汁中键合态香气物质，发现微生物来源的β-葡萄糖苷酶对键合态组分的酶解效果略强于杏仁酶的酶解效果。范刚等［16-17］也采用外源β-葡萄糖苷酶水解释放出了锦橙中的键合态香气物质。叶顺君等［18］则发现杏仁β-葡萄糖苷酶对橙汁和柠檬汁中键合态香气物质的酶解效果好于黑曲霉β-葡萄糖苷酶的酶解效果，且他们采用Kramer 感官评定法研究发现采用糖苷酶酶解橙汁具有明显的增香效果。张瑶等［19］等研究了新鲜柠檬汁经β-葡萄糖苷酶处理后香气物质的变化，结果发现酶解后，柠檬汁中香气物质的总量增加了11%。由此可见，外源β-葡萄糖苷酶对柑橘汁的香气物质存在一定影响，能够水解释放柑橘中的键合态香气物质，增加柑橘香气物质的含量。Fan 等［20］比较了柑橘果酒中键合态香气物质酿造前后的变化，并发现共有8 种键合态香气物质在发酵过程中被水解释放。

柑橘成熟过程中内源β-葡萄糖苷酶也可以释放出部分键合态萜类物质，因此可通过外加β-葡萄糖苷酶增强柑橘加工制品及加工副产品的香气与风味。例如将β-葡萄糖苷酶应用于柑橘精油、柑橘果酒以及柑橘汁的提取加工工艺中，使得产品的特征香气更加浓郁。

3 柑橘中β-葡萄糖苷酶的其他作用

β-葡萄糖苷酶也可以分解一些苦味物质，使得一些具有苦味的果实加工制品的口感得到改善。例如:梅子中含有大量的苦味物质，使得其加工制品的口感较差。而这些苦味物质中最主要的就是苦杏仁苷。β-葡萄糖苷酶可以分解苦杏仁苷，使得其苦味大大减轻。然而，在柑橘中则恰恰相反，柠檬苦素类化合物是柑橘中的主要苦味物质。这类物质在柑橘中与糖类物质通过糖苷键结合以糖苷的形式存在，据报道，柠檬苦素类化合物糖苷在橙汁中的含量约为320mg/kg［21］，在柑橘种子中的含量达干重的0.8%［22］。柠檬苦素类化合物糖苷经β-葡萄糖苷酶水解后，释放出柠檬苦素类物质，引起橙汁苦味。Ronneberg 等［23］研究发现未发芽及发芽柠檬种子中的诺米林17-β-D-吡喃葡萄糖苷(nomilin 17-β-D-glucopyranoside)被水解为诺米林，说明柠檬种子中含有水解糖苷的β-葡萄糖苷酶，并指出榨汁过程中种子被碾碎后，其中的β-葡萄糖苷酶融入果汁中容易水解柠檬苦素类物质糖苷，释放出苦味物质，造成果汁的苦味，因此在榨汁过程中要尽量防止种子被碾碎。

β-葡萄糖苷酶还与血橙中花色苷的降解有一定关系，Barbagallo 等研究发现血橙中的花色苷含量在果实完熟时最高，之后减少，而在这个过程中，β-葡萄糖苷酶的活性增高，因此他们认为，β-葡萄糖苷酶在血橙花色苷降解过程中起到了一定作用［8］。

β-葡萄糖苷酶存在于许多植物中，其在植物中的作用除水解糖苷键以外，还有很多未被发现的作用，国外研究报道水果中的β-葡萄糖苷酶在细胞壁代谢中也具有重要作用［24-25］。糖苷水解酶具有双重性，即根据来源的不同，既可行水解酶活性，又可行糖基转移酶活性，可以用于酶促糖苷化反应［26］。

4 展望

β-葡萄糖苷酶分布于柑橘果实的各个部位，在柑橘果实键合态香气水解释放、柠檬苦素类物质糖苷水解及花色苷降解过程中起到重要作用。然而由于β-葡萄糖苷酶对环境的条件较为敏感，极易在柑橘的采摘和加工过程成失活或者变性，从而无法对香气的释放做出贡献。目前通过保持柑橘中β-葡萄糖苷酶的活性进而保持柑橘果实及其加工制品的香气主要有两种途径:一是尽量缩短采摘及加工的时间，在加工过程中避免长时间高温处理。二是在制品中加入外源的β-葡萄糖苷酶。

目前，国内外的研究学者已经对各种不同来源的β-葡萄糖苷酶的提取、纯化及酶学性质进行了大量的研究。然而，对于柑橘中的β-葡萄糖苷酶的研究还比较少，尤其是内源糖苷水解酶在糖苷香气前体体内形成与水解释放中的作用及其影响因素也鲜有报道，其在柑橘中糖苷香气前体合成及释放中的作用需要进一步明确。

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