几种榆属植物组织培养研究进展

李 雯，王秀华

(东北林业大学生命科学学院，哈尔滨150040)

榆树，双子叶植物，树皮粗糙，具实用及药用价值，主要用于造林、绿化;榆树嫩果和幼叶可以食用或作饲料，同时可入药等。榆属常见树种为白榆、春榆、脱皮榆和黄榆等，其适应性极强，喜光、耐寒、耐旱、耐瘠薄，不择土壤［1］;根系发达，抗风力、保土力强;萌芽力强，耐修剪;生长快，寿命较长。

近年来，随着对榆树研究的发展和深入，传统的育种工作受到了分子生物学等最新研究成果的冲击，国内外许多研究已转向遗传学基础研究［2－4］，但有一系列问题尚未解决，本文总结榆属常见树种组织培养近况，讨论不同培养基及激素对其愈伤组织诱导、分化及生根的影响，获得高效率的外植体再生体系，为今后榆树基因工程改良作物提供理论依据和基础材料。

1 材料的选取与处理

1.1 材料的选取

组织培养的选材很重要，会直接影响实验效果。外植体的选材应充分考虑取材部位、大小和供体植株的生理状况等因素，因为植物细胞具有全能性，理论上讲选用植株的任何部位都能诱导成株，但是实验表明，植株的不同部位诱导结果还是有很大差别的，因此在选取外植体时应挑选诱导能力强的，如幼叶、茎段、茎尖和腋芽［5］等。

榆树组织培养材料选取通常有两种途径［6］:一种是直接取自野生植株不同部位作为外植体。另外一种是利用榆树种子萌发，然后取无菌苗的不同部位作为外植体，第二种方法的优点是减少了外植体染菌的机率，提高了实验效率。

1.2 材料的采摘与处理

实验如果选取野生植株作为外植体，尽量选取植株生长旺盛且气温较凉爽的季节，通常4～5月份取材比较适宜。如王静华、侯建生等人取白榆当年生健壮带芽茎段［7］;图亚等人取黄榆的叶片［8］;林静芳取春榆树冠中部新梢切断作为外植体材料［9］，通常剪成2㎝左右长，先对材料进行预处理，用洗衣粉清洗其表面灰尘及部分菌体，再用自来水冲洗30～45 min。然后将清洗后的外植体在超净工作台上，用75%酒精浸泡30 s，2%次氯酸钠消毒液浸泡3～5 min，无菌水冲洗4～5次，用无菌滤纸吸去水分，接种于激素浓度合适的基本培养基上，其中灭菌时间要根据材料的不同适量调整，时间短易造成材料消毒不充分而致初代培养时污染率高，时间过长则可能造成外植体的黄化和褐化。

实验如果选取种子进行萌发，在当年5～6月间，当榆树的果实由绿色变为黄白色、中部隆起即可采收，种子质量应达到GB7908林木种子质量分级规定的I级和II级标准［10］，放于通风处自然阴干，随采随用，同样用洗衣粉清洗其表面，再用自来水冲洗3～5 h。然后将清洗后的种子在超净工作台上，用75%酒精浸泡1 min，5%次氯酸钠消毒液浸泡8～10 min，无菌水冲洗4～5次，用无菌滤纸吸去水分，接种到不添加任何激素的基本培养基上，待其长出无菌苗即可取材实验。

2 培养基的选择与激素调节

2.1 培养基的筛选

植物组织培养所需要的营养成分全部来自培养基，其供应状况直接关系到培养物的生长与分化，因此了解培养基的成分、特点及其配制至关重要。通过众多人实验，如图亚通过对蒙古黄榆的愈伤组织诱导过程中的比较发现，MS培养基诱导率明显比LP、DCR培养基高，且愈伤产生的情况及生长状况也较优［11］;张建锋、彭冶、唐晓杰、林静芳等人通过实验对比发现，白榆、金叶榆和春榆等的最适增殖培养基也为 MS 和 1/2MS 培养基［9，12－14］。因此榆树组织培养的最适基本培养基为MS，培养基加蔗糖20 g/l，琼脂6.5 g/l，附加不同的浓度及不同种类的激素。

2.2 激素种类及浓度的影响

激素在植物组织培养中起着关键作用，因此正确的选择适合的激素及对激素使用量的控制很重要。

2.2.1 激素种类

从榆属常见树种的组培结果来看，增殖培养基通常为MS+6－BA+IBA，6－BA可以高效的从顶芽、侧芽和茎段诱导芽增殖。具体要根据材料地域不同进行试验;最适的生根培养基通常为MS或者1/2 MS+IBA，从生根率看，MS普遍比1/2MS效果好，在叶片、胚轴作为外植体诱导不定芽时，TDZ通常比6－BA诱导率高;2，4－D，KT等激素也被用于榆树组培中，但是诱导效果不明显，被证明不适合榆属组织培养，在黄榆、春榆的生根培养中，添加NAA有利于生根率的提高，但是在白榆的培养基中添加NAA很容易玻璃化，生根率低，是否因为白榆对NAA比较敏感没有具体研究。另外通常往培养基中添加少量的赤霉素来防止小植株基部形成愈伤组织而导致成活率下降［15］。

2.2.2 激素浓度配比范围

经王静华等人实验证明，最适白榆增殖培养基是MS+6－BA 0.10mg/l+IBA 0.005mg/l，同时其也添加少量NAA，但是白榆极易产生玻璃苗。最适生根培养基是MS+IBA 0.01mg/l;叶片再生最适培养基为MS+TDZ 0.005mg/l+IAA 0.005mg/l，但是叶片再生能力较弱，有待进一步研究［16］。杜盛等人经多次试验发现最适合脱皮榆的增殖培养基为MS+(1.5 ～2.0)mg/l BAP+0.01mg/l NAA［17］;唐晓杰在对金叶榆组培中证明，MS+6－BA 1.0mg/l+IBA 0.1mg/l培养基中不定芽增殖数量最多［14］。

综上，增殖培养基通常浓度配比范围为6－BA(0.1～2.0)mg/l，IBA(0.005 ～0.1)mg/l，具体要根据材料地域不同进行试验，选取合适的浓度范围进行培养;最适的生根培养基IBA通常浓度范围(0.01～1.0)mg/l，IBA浓度增加，根会变粗壮，但当IBA浓度超过1.0mg/l时，就会抑制根伸长，有毒物质积累，出现瘤状物，因此要根据具体材料调节浓度。

3 组织培养中的其他影响因素

3.1 温度 光照的影响

研究表明，榆树培养室温度应控制在25±2℃，温度过高不利于生长，容易长菌;温度过低，不利于光合作用。光照强度2000～3000 Lx，光照时间为10 h［7］，同时配合8～10 h的暗处理对初始诱导有更好的效果，因为愈伤组织最初出现芽体需在黑暗中培养［18］，然后再光下进一步培养产生大量芽体，具体时间还要根据材料灵活选择。

3.2 pH的选择

榆树最适pH为5.8～6.0，符合其野外生长土壤环境，微酸性环境下幼苗生长有利，存活率较高。同时在配置培养基时，要充分考虑到灭菌前后pH变化而进行调试，防止因为灭菌过后pH降低，影响培养基质量。

3.3 培养基中的C/N

培养基中蔗糖，为培养物的生长发育提供所需的能量和底物，同时也影响植物的渗透势;反过来，培养基的渗透势也对培养物的代谢起调节作用。

李天珍、李保堂等人通过对白榆新稍生根的研究发现，当培养基的蔗糖浓度较低时，根系的发生主要受能量和底物供给的限制，渗透势的调节则处于次要地位，随着蔗糖浓度的提高，能量和底物的供给达到饱和，这时蔗糖浓度再进一步提高，起到了调节渗透势的作用，同时促进生根。在培养基中加入NO3－或NH4+作为氮源时，在测试范围内对生根有抑制作用，降低新稍的生根率。结果表明，含有高浓度蔗糖的培养基比低浓度蔗糖的培养基生根率高。即C/N比高有利于生根［19］。

因此在生根实验中，应特别注意在合适范围内适当提高C/N比，高浓度的蔗糖有利于提高生根率。

4 白榆组织培养的生根问题

4.1 试管内生根

实验证明，王静华在不添加任何激素的MS培养基中也可以让白榆生根但生根率较低，添加IBA后更适合生根，且平均茎高、平均根长、生根率和生根系数均高于不添加任何激素的培养基［7］。将长势较好的试管苗接种，待新稍长到30～40 mm左右时，如唐晓杰等在金叶榆试管苗长出3～5条不定根，根长1.5 cm时［14］，在培养室内打开培养瓶口炼苗2～3 d，炼苗过程需注意补水，防止幼苗缺水干枯。

4.2 试管外生根和移栽

炼苗结束后取出植株，洗净根上的琼脂，在10%多菌灵溶液中浸泡15～20 min后扦插到装有蛭石+珍珠岩+草炭土=1∶1∶1的花盆中，因为蛭石和珍珠岩透水透气性好，而草炭土能提供充分的营养，此基质组合为最佳［11］。开头3～5 d暗处理，以后逐渐增加光照，不断浇水，15～20 d左右检查，看生根情况，进行统计生根率和成活率。

组织培养中试管内生根有一定的弊端，生根不旺盛，容易感染杂菌，移栽过程中容易死亡，导致移栽存活率较低。因此试管外生根将试管苗生根和驯化结合起来，大大提高了繁殖系数，有利于大规模培养。

5 展望

组织培养由于具有缩短育种时间、提高植物品质以及保存物种等优点，已经在很多植物中获得成功。近些年来，通过对不同外植体的诱导已经获得了不同种榆的再生植株，但是榆树的组织培养体系并不是完全成熟，存在一些急需解决的问题:比如在组培过程中，外植体经常存在褐变现象，有研究称褐变主要是PPO作用于天然底物酚类物质而引起的，因此在培养基中加入抗氧化剂和其他抑制剂可以抑制褐变［20］，陈学森等在银杏组织培养中应用植酸作抗氧化剂，取得了一定成效［21－23］。但是具体的是否适用于榆树组培还有待进一步研究;在继代培养中出现玻璃化苗、白化苗等现象的具体原因以及克服方法也还没有明确的研究。

因此在愈伤组织分化时，根据内源激素的要求，在培养基中添加合适的外源激素来进行调节，从再生角度考虑，继续扩大基因型筛选范围，寻找对再生敏感的基因型［17］是今后努力的方向，相信通过不懈努力，榆树的组织培养工作将会取得更大的成绩，使其综合利用价值更高。

［1］周以良.黑龙江省植物志(第四卷)［M］.哈尔滨:东北林业大学出版社，1992.

［2］ Santamour F S.Interspecific hybridization with in fall and spring flowering［J］.Forest Science，1972，18:283 － 289.

［3］ Kamalav J C，Carey D W.Application of RAPD PCR markers for identification and genetic analysis of American Elm(Ulmus amer icana)selection［J］.Journal of Environmental Horticulture，1995，13(4):155－159.

［4］ Kapaun J A，Cheng Z M.Plant regeneration from leaf tissues of Siberian elm［J］.HortScience，1997，32(2):301 －303.

［5］ 张 健，王 颖，吴坤鑫，等.白木香组织培养研究进展［J］.中国园艺文摘，2011(6):42－44.

［6］张在盛，王秀华.越桔组织培养的相关研究［J］.森林工程，2011，27(6):23 －25.

［7］王静华，侯建生，刘桂林，等.白榆的组织培养与叶片再生研究［J］.西北林学院学报，2009，24(5):74 －77.

［8］图 亚，叶冬梅，张文泉，等.蒙古黄榆愈伤诱导及植株再生的初步研究［J］.内蒙古农业大学学报，2012，33(1):38 －42.

［9］林静芳，董茂山，黄钦才.春榆组织培养苗移植成功［J］.林业科技通讯，1981(5):2－4.

［10］李秀文，姜树新，王玉忠.白榆育苗技术要点［J］.河北林业科技，2010(1):87－88.

［11］图 亚.蒙古黄榆组织培养及植株再生的研究［D］.呼河浩特:内蒙古农业大学，2011.

［12］张建锋，龙庄如，梁玉堂.白榆新品种74009离体培养再生植株的研究［J］.山东林业科技，1991，81(04):18 －21.

［13］彭 冶，张金池.美国岩榆愈伤组织的诱导及不定芽形成［J］.东北林业大学学报，2007，35(12):6 －7.

［14］唐晓杰，孟范例，程广有.金叶榆组培快速繁殖技术研究［J］.北方园艺，2010(21):156 －158.

［15］宛淑艳，张常钟，陆静梅，等.大豆组织培养和原生质培养研究的进展［J］.长春师范学院学报，2002，21(1):57 －60.

［16］王静华，侯建生，刘桂林，等.两种不同种源地白榆的组织培养与叶片再生研究［J］.中国农学通报，2009，25(5):110 －115.

［17］杜 盛，闫美杰.脱皮榆离体培养再生植株的研究［J］.内蒙古林学院学报，1996，18(4):15 －17.

［18］杨捷威，吴婷婷，郭美丽.红花组织培养的研究进展［J］.药学服务与研究，2010，12(1):58 －61.

［19］李天珍，李保堂，王笑然.糖和氮对白榆组织培养新梢生根的影响［J］.山西林业科技，2001(4):9 －11.

［20］梁一池，杨 华.植物组织培养技术的研究进展［J］.福建林学院学报，2002，22(1):1 －3.

［21］陈学森，张艳敏，董 会.植酸在银杏组织培养中应用的研究［J］.天然产物研究与开发，1997，9(2):24 －27.

［22］蔡祖国，符树根，黄宝祥，等.植物组织培养中玻璃化现象的研究进展［J］.江西林业科技，2005(2):35－38.

［23］牛艳丽，张艳芳，杜 娟，等.植物细胞无性系变异的研究进展［J］.江西林业科技，2009(3):32 －34.