应用基因敲除和RNA干扰技术研究睾丸特异性新基因

廉 靖，王朝亮，王 瑞，李 锐，张天标，张卫星

(郑州大学第一附属医院泌尿外科 河南郑州 450052)

睾丸特异性基因(testis-specific-gene)，是指主要在睾丸组织中表达，而在机体其他组织中不表达或者极低表达的基因。睾丸特异性基因主要与睾丸功能有关，此类基因的正常表达多与睾丸雄激素产生、精子发生有关。部分睾丸特异性基因不仅与睾丸功能有关，还具有其他生物学特性，在机体正常发育过程中起重要作用。利用基因敲除(Gene knockout)技术和RNA干扰(RNA interference)技术选择性敲除或沉默睾丸特异性基因，并建立目的基因缺失或目的基因表达减弱动物模型是研究此类基因功能的首选方法。

1 基因敲除技术研究睾丸特异性基因功能

基因敲除是根据DNA同源重组的原理而设计的一项技术，通过DNA分子的同源重组，特异性地在基因组的某个位点引入预定的突变，进而获得基因型发生了改变的基因打靶小鼠，以研究目的基因的体内功能或相关疾病的致病机制［1］。

1.1 精子发生相关的睾丸特异性基因 哺乳类动物的精子发生(spermatogenesis)需经过有丝分裂、减数分裂和精子形成3个阶段，最终由二倍体精原细胞形成单倍体精子，此过程必须经历一系列不同于体细胞发育的生物学事件，包括姐妹染色体遗传交换、核固缩、染色质重建、顶体和鞭毛形成等［2］。这一独一无二的发育过程，是大量睾丸特异性基因按时空顺序表达与睾丸组织内外环境共同作用的结果，例如，CERM［3］、H1t［4］、MTL-5［5］、Cdc2［6］、Dmcl［7］等皆被证明为睾丸特异性基因并在精子发生过程中起重要作用，这些睾丸特异性基因表达缺失会导致精子细胞数目减少、形态畸形、活动能力下降、凋亡增多，进而导致雄性不育，主要包括以下几类基因。

1.1.1 影响精子活动能力的睾丸特异性基因:良好的精子活动能力是男性正常生殖的必要条件之一，精子活动能力下降会直接导致男性不育。

近年来，国内外科学家发现了许多影响精子活动能力的睾丸特异性基因。试验观察发现，Catsper3、Catsper4基因敲除雄性小鼠和野生型雄性小鼠的睾丸重量、精子计数在8～10周龄没有显著差异，但是Catsper3、Catsper4基因缺失雄性小鼠的精子室温下经过HTF培养基2 h孵育后，其活动精子比率和野生型雄性小鼠相比明显下降。交配试验证明，Catsper3、Catsper4基因缺失雄性小鼠不能引起野生型雌性小鼠受孕，上述资料表明，在精子获能过程中精子超激活需要CatSper3、CatSper4的存在［8］。

另一个和精子活动能力相关的睾丸特异性基因是CD59b，CD59是位于细胞膜上的与阵发性睡眠性血红蛋白尿(PNH)发病有关的蛋白质。近年来，英国科学家在mRNA和蛋白质水平证明，CD59b基本上仅在成年雄性小鼠的睾丸组织表达，CD59b在其他组织中的微量表达是由血细胞污染引起的。进一步的研究发现CD59b主要在精子的顶体部位表达，其mRNA在睾丸组织中的表达和青春期的发育同步，这些资料表明CD59b很可能与顶体功能有关，CD59b缺失将会导致精子获能障碍，资料表明睾丸特异性基因CD59b在调节精子活动能力方面具有非常重要的作用，这些发现和以前CD59b基因敲除小鼠模型所证明的(CD59b－/－)雄性小鼠渐进性不育、精子活性减弱相吻合［9］。

1.1.2 影响精子形态的睾丸特异性基因:精子发生过程起始于干细胞的分化，终止于成熟精子的形成，在此过程中，精子形态异常、精子畸形会导致男性不育。

Yan等采用常规的基因敲除技术发现精子细胞成熟因子1(Spem1)基因在小鼠精子细胞胞质去除(Cytoplasm Removal)的基因调控中起重要作用，实验研究发现Spem1基因敲除雄性小鼠不育，精子胞质去除异常、精子头部因精子尾巴的缠绕而弯曲畸形［10］。此外，德国科学家在研究睾丸特异性基因Tex18时发现，Tex18基因敲除雄性小鼠生育力低下，进一步的实验观察发现Tex18基因敲除雄性小鼠精子头部畸形，活动能力低下［11］。

1.1.3 影响精子数目的睾丸特异性基因:精子数目减少，是雄性不育的原因之一。美国罗彻斯特大学科学家在研究睾丸孤儿细胞核受体4(TR4)基因时发现TR4在雄性小鼠出生后16～21 d表达量最高，并且TR4特异性、阶段依赖性表达于粗线期后期精母细胞和圆形精子细胞，该基因缺失会导致精子发生障碍，精子数目减少，TR4基因敲除雄性小鼠体重下降、睾丸重量减轻、生育力低下、睾丸组织切片结果显示初级精母细胞变性、部分睾丸精曲小管坏死。与野生型雄性小鼠相比(TR4－/－)雄性小鼠精子发生延迟，进一步的机制研究表明，(TR4－/－)雄性小鼠精子发生延迟由精子发生过程中减数分裂异常引起。此外，对TR4基因敲除雄性小鼠其他基因的表达分析发现，睾丸特异性基因Sperm 1和Cyclin A1在(TR4－/－)雄性小鼠体内表达延迟并同时伴有表达减弱［12］。由此可知，TR4基因是睾丸组织产生正常数目精子所不可缺少的条件之一，TR4基因很可能与Sperm 1和Cyclin A1相互作用，协同促进正常的精子发生过程。

综上所述，在精子发生过程中有许多睾丸特异性的基因表达，分析睾丸特异性基因表达谱，筛选和鉴定精子发生过程中起重要作用的睾丸特异性基因，研究其特性和功能，对理解精子发生的内在机理、防治由精子发生异常引起的男性不育、研制男性避孕药等具有重要意义。

1.2 雄激素产生相关的睾丸特异性基因 雄激素对于睾丸发育、第二性征成熟、性欲的维持以及促进精子发生有重要作用。睾酮是男子体内最重要的雄激素，动物体内许多睾丸特异性基因缺失都会影响睾丸合成睾酮的功能或者影响睾酮功能的正常发挥，睾酮浓度过低或者睾酮正常功能发挥受阻，睾丸生精功能就会显著减退进而导致雄性生殖能力下降。

目前，与睾丸雄激素产生相关的睾丸特异性基因的研究报道不多，近年来，国内外的专家学者通过建立基因敲除小鼠模型发现了许多影响睾丸雄激素合成的基因，如G蛋白偶联受体GPRC6A基因、组氨酸脱羧酶(HDC)基因、芳香烃受体(AhR)基因等，并初步研究了它们在睾丸雄激素合成过程中的作用。实验研究发现，GPRC6A基因敲除雄性小鼠睾丸体积、精囊腺重量明显下降，血液睾酮浓度显著降低［13］。组氨酸脱羧酶(HDC)基因敲除雄性小鼠睾丸间质细胞的类固醇激素合成能力显著下降，主要表现为睾丸间质细胞的基础睾酮分泌水平和在hCG诱导下的睾酮分泌水平都下降［14］，而芳香烃受体(AhR)基因敲除雄性小鼠则有30%表现为血液睾酮浓度显著下降［15］。由此可知，上述3个基因在睾丸间质细胞功能调节和睾丸类固醇激素的合成过程中具有非常重要的作用。

2 RNA干扰技术研究睾丸特异性基因功能

RNA干扰(RNA interference，RNAi)，又称为gene knock-down，是发生于动物、植物机体中的转录后基因沉默现象，此过程主要由双链RNA(dsRNA)同源互补于靶基因的mRNA来完成。作为现代生物医学研究的焦点，RNA干扰技术被广泛应用于勃起功能障碍、前列腺癌和精子发生等方面的研究［16］。RNA干扰技术方便、快捷，克服了基因打靶费时、费用高昂等缺点［17］，是除基因敲除技术外在活体内研究睾丸特异性基因功能的又一方法，国内外研究学者已经利用RNA干扰技术建立了许多睾丸基因表达减弱动物模型，进而揭示目的基因的功能。我国科学家利用RNA干扰(RNAi)技术，研究发现昼夜节律钟基因与雄性小鼠的生殖功能有关，它很可能通过调节精子顶体蛋白的活性进而影响精子的受精能力［18］。

虽然RNA干扰技术方便快捷，但是由于RNA干扰技术不能作用于所有基因和某些特殊类型的细胞(神经元)，而且RNA干扰技术只是在转录后水平上降低目的基因的表达，其基因沉默效果远不如基因敲除技术干净彻底，有时也会因基因沉默不彻底导致动物模型表型难以分析。因此RNA干扰技术在研究睾丸特异性基因功能方面的应用远没有基因敲除技术广泛。

3 结语

睾丸的主要功能是分泌雄激素睾酮和产生精子。睾酮不仅参与精子形成，且能促进生殖器官和第二性征的发育，并保持男性特有的生理功能;精子的主要功能是与卵子结合形成受精卵进而产生后代。哺乳类动物的精子发生是一个不同于体细胞分化的特殊过程，这一特殊的细胞分化过程受多种因素的调控，而生精细胞内基因水平的调节，在精子发生过程中起着决定性的作用［19］。

近年来随着基因克隆、表达及功能研究技术的发展与应用，人们发现了许多与精子发生相关的基因，其中主要是睾丸特异性基因在精子发生中起重要作用。这些睾丸特异性基因具有发育阶段特异性和组织细胞特异性的表达特征，并参与精子发生过程中特异的细胞活动。然而对于这一过程中许多关键基因及其功能还知之甚少，需要进行更加广泛深入的研究，基因敲除技术和RNA干扰技术是目前研究基因功能的主要方法技术。近年来，越来越多的睾丸特异性基因逐渐被人们发现，如 TSF22［20］、BAFL、T490、TSC21、TSC23、TSC43、RGS22［21］、TDRG1［22］、TSEG-2［23］、TSAF76、mtIQ1［24］、mtIQ2等，进一步探讨其基因表达模式、研究其功能特性将有助于我们更好的了解它们在男性生殖方面所起的作用，为男性疾病的治疗开辟新的道路。

［1］ Verena G，Stefan S，Andrea S，et al.Targeted disruption of Slc2a8 (GLUT8)reduces motility and mitochondrial potential of spermatozoa［J］.Mol Membr Biol，2008，25(3):224-235.

［2］ Wei Y.Male infertility caused by spermiogenic defects:lessons from gene knockouts［J］.Molecular and Cellular Endocrinology，2009，306(1-2):24-32.

［3］ Juvan P，Perse M，Budefeld T，et al.Novel insights into the downstream pathways and targets controlled by transcription factors CREM in the testis［J］.PloS one，2012，7(2):e31798.

［4］ Bukowska D，Kempisty B，Piotrowska H，et al.The structure and role of mammalian sperm RNA:a review［J］.Veterinarni Medicina，2013，58(2):57-64.

［5］ Skutkova H，Babula P，Stiborova M，et al.Structure，polymorphisms and electrochemistry of mammalian metallothioneins-a review［J］.Int.J.Electrochem.Sci，2012，(7):12415-12431.

［6］ Yu B Z，Song Y T，Yu D H，et al.Expression and immunohistochemical localization of Cdc2 and P70S6K in different stages of mouse germ cells［J］.Cell Biochemistry and Function，2006，24(2): 113-117.

［7］ Masson J Y，Davies A A，Hajibagheri N，et al.The meiosis-specific recombinase hDmcl forms ring structures and interacts with hRad51［J］.The EMBO Journal，1999，18(22):6552-6560.

［8］ Jingling J，Nange J，Huili Z，et al.Catsper3 and Catsper4 are essential for sperm hyperactivated motility and male fertility in the mouse［J］.Biology of reproduction，2007，77(1):37-44.

［9］ Sivasankar B，Claire L H，Rossen M D，et al.CD59a is the primary regulator of membrane attack complex assembly in the mouse［J］.The Journal of Immunology，2004，73(6):3684-3692.

［10］Huili Z，Clifford J S，Kazuto M，et al.Lack of Spem1 causes aberrant cytoplasm removal，sperm deformation，and male infertility［J］.Proceedings of The National Academy of Sciences of the USA，2007，104(16):6852-6857.

［11］Jaroszynski L，Dev A，Li M，et al.Asthenoteratozoospermia in mice lacking testis expressed gene 18(Tex18)［J］.Molecular human reproduction，2007，13(3):155-163.

［12］Xiaomin M，Yifen L，Ningchun L，et al.Targeted inactivation of testicular nuclear orphan receptor 4 delays and disrupts late meiotic prophase and subsequent meiotic divisions of spermatogenesis［J］.Molecular and Cellular Biology，2004，24(13):5887-5899.

［13］Min P，Ling C，Minzhao H，et al.GPRC6A null mice exhibit osteopenia，feminization and metabolic syndrome［J］.PLoS ONE，2008，3(12):e3858.

［14］Mondillo C，Falus A，Pignataro O，et al.Prolonged histamine deficiency in histidine decarboxylase gene knockout mice affects leydig cell function［J］.Journal of Andrology，2007，28(1):86-91.

［15］Baba T，Shima Y，Owaki A，et al.Disruption of Aryl Hydrocarbon Receptor(AhR)induces regression of the seminal vesicle in aged male mice［J］.Sexual Development，2008，2(1):1-11.

［16］Wan H，Xiong C L.RNA interference and its application in andrology research［J］.Zhonghua Nan Ke Xue，2008，14(6):545-549.

［17］Williams C J，Schultz R M.Transgenic RNAi:A tool to study testisspecific genes［J］.Molecular and Cellular Endocrinology，2006，247 (1-2):1-3.

［18］Jiang X H，Zhang L，Wang Y H，et al.The influence of circadian clock gene on mouse sperm fertility in RNAi［J］.Sichuan Da Xue Xue Bao Yi Xue Ban，2008，39(6):929-932.

［19］Tang A，Yan Q，Sun L，et al.Developmental expression of ACRV1 in humans and mice［J］.Andrologia，2012，44(1):16-22.

［20］Aifa T，Yaoting G，Zhiming C，et al.Cloning and character Analysis of a novel testis-specific Gene，TSF22，in mice［J］.Journal of Reproduction and contraception，2007，18(1):11-18.

［21］Yanqiu H，Jun X，Ling C，et al.RGS22，a novel testis-specific regulator of G-protein signaling involved in human and mouse spermiogenesis along with GNA12/13 subunits［J］.Biology of Reproduction，2008，79(6):1021-1029.

［22］Yin G M，Yang J F，Jiang X Z，et al.Molecular cloning of a novel human testis-specfic gene TDRG1［J］.Journal of Southern Medical University，2009，29(4):631-634.

［23］Wang Z Y，Tong Q S，Zeng F Q，et al.Cloning and expression of a novel mouse testis gene TSEG-2［J］.Zhonghua Nan Ke Xue，2009，15(2):99-105.

［24］Hu J R，Xu N，Tan F Q，et al.Molecular characterization of a KIF3A-like kinesin gene in the testis of the Chinese fire-bellied newt Cynops orientalis［J］.Molecular biology reports，2012，39(4): 4207-4214.