高效液相色谱法与荧光偏振免疫法测定人全血环孢素A浓度的比较

环孢素A(CsA)是一种强效免疫抑制剂，临床主要用于预防同种异体肾、肝、心脏等器官或组织移植所发生的排斥反应，也用于预防及治疗骨髓移植时发生的移植物抗宿主反应，由于临床应用CsA使移植器官存活率提高了80％～90％。但CsA治疗指数窄，个体差异较大，血药浓度过高可引起肝肾毒性，过低则易发生排斥反应。因此，监测CsA在全血的浓度，调整其浓度在安全有效范围具有重要的临床意义[1]。

目前，测定环孢素血药浓度的方法主要有高效液相色谱(HPLC)法、荧光偏振免疫(TDx)法、高效液相质谱联用(LC/MS)法、高效毛细管电泳(HPCE)法、放射免疫(RIA)法和受体结合(RBA)法[2-4]。由于血药浓度监测方法不统一，监测结果存在很大差异，根据不同方法所确定的治疗药物浓度范围也不同，这给临床应用和评价带来不便。国内外均有报道关于各种测定方法间比较[4-7]，国内医院多采用单克隆TDx法，此法对环孢素的体内代谢产物产生交叉免疫反应，实际测得结果为CsA及代谢物之和。HPLC法测定结果为CsA原型药物浓度，因此能更准确地说明药物浓度、疗效、不良反应三者间的关系[8]。为更好地指导临床合理用药， 本研究拟以TDx监测方法为参照，对CsA全血样本进行HPLC分析，考察两种方法的相关性。

对象与方法

样品来源标本全部来自南京军区福州总医院泌尿外科、血液科、肾内科住院患者和门诊随访患者常规监测全血样本。本试验分别用HPLC法和TDx法对92例患者的全血标本进行了检测。

仪器Agilent1200 HPLC仪(美国Agilent公司)；AL204精密电子天平(梅特勒-托利多仪器有限公司)； LD5-2A型台式离心机(北京医院离心厂)；TGL-16C高速台式离心机 (上海安宁科学仪器厂)；电热恒温水浴锅(上海医疗器械五厂)； BF2000氮气吹干仪(北京八方世纪科技有限公司)；荧光偏振免疫分析仪(TDxFLx，美国Abbott公司)。

试剂CsA试剂盒(批号:69398Q101,美国Abbott公司)；CsA质控盒(120085JN00 2012-04-07)。CsA对照品(福建科瑞医药有限公司，批号：130495．200202，纯度99．7％)；环孢素D(CsD)对照品(福建科瑞医药有限公司，批号：0104006 416，纯度99.0％)；乙腈、甲醇(色谱纯；上海科丰化学试剂有限公司)；正己烷(分析纯；上海科丰化学试剂有限公司)；乙醚(分析纯；上海联试化工试剂有限公司；使用前重蒸馏)。

HPLC法测定血药浓度

色谱条件 色谱柱为Inertsil CN(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相为乙腈∶水(38∶62，v/v)；流速1.0 ml/min；检测波长210 nm；进样量20 μl；柱温55℃。

对照品溶液的制备 CsA溶液的配制：称取CsA对照品约10 mg，精密称定，置于10 ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得浓度为1000 mg/L的CsA储备液，置4℃冰箱中保存备用。使用前取出平衡至室温后，取适量储备液用甲醇稀释成浓度分别为40 ng/ml、80 ng/ml、200 ng/ml、400 ng/ml、800 ng/ml、1200 ng/ml和2500 ng/ml的CsA对照品溶液。

CsD内标液的配制：称取CsD对照品约10 mg，精密称定，置于10 ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得浓度为1000 mg/L的CsD储备液。精密量取该储备液1 ml，置于25 ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得浓度为40 mg/L的CsD内标溶液，置4℃冰箱中保存备用。

血样处理方法 取1.0 ml全血样品置15ml玻璃离心管中，加入10 μl内标液(相当于400 ng CsD)、500 μl 0.2 mol/L NaOH溶液，涡旋30s，加入5 ml重蒸乙醚，涡旋提取3 min，4000 r/min离心10 min，取乙醚层4 ml于5 ml的离心试管中，40℃氮气吹干，加入水∶乙腈(1∶1)100 μl复溶，涡旋30s，加入200 μl正己烷(用乙腈饱和)，涡旋30s，4000 r/min离心15 min，取下层溶液进样分析。

方法专属性 取空白全血1 ml，除不加内标外，按“血样处理方法”项下全血样品处理方法操作，进样20 μl，记录色谱图；将一定浓度CsA和内标溶液加入空白全血，依同法操作，记录色谱图；取受试者服药后收集的血液样品，依同法操作，记录色谱图(图1)。结果表明，空白全血中内源性物质不干扰CsA和内标的测定。

图1 CsA高效液相色谱图

标准曲线绘制 取空白全血1ml，加入“对照品溶液的制备”项下CsA对照品各溶液10 μl，配制成相当于CsA浓度为40 ng/ml、80 ng/ml、200 ng/ml、400 ng/ml、800 ng/ml、1200 ng/ml和2500 ng/ml的模拟人全血样品，按“血样处理方法”项下全血样品处理方法操作，进样20μl，记录色谱图。以待测物浓度为横坐标(X)，待测物与内标物峰面积比值为纵坐标(Y)，用加权(W=1/x2)最小二乘法进行回归运算，求得直线回归方程为：Y=2.209×10-3X+3.841×10-2，r=0.9997。结果表明，CsA在40～2500 ng/ml浓度范围内线性关系良好，定量限为40 ng/ml。

精密度和准确度 取空白全血1 mL，按“标准曲线绘制”项下方法配制CsA低、中、高三个浓度(分别为80 ng/ml、400 ng/ml、2000 ng/ml)标准全血样品，按“血样处理方法”项下全血样品处理，每一浓度进行5个样本分析，连续测定3d，记录测得浓度，计算日内、日间精密度和回收率(表1)。

表1 精密度和准确度结果

样品稳定性 取空白全血1 ml，按“标准曲线绘制和定量下限”项下方法配制CsA低、中、高三个浓度(分别为80 ng/ml、400 ng/ml、2000 ng/ml)质量控制(QC)生物样品，于室温放置8 h、-20 ℃冷冻放置30d和经三次冷冻-解冻循环处理后，考察样品稳定性。每批次5样本分析。结果表明CsA人全血样品在上述条件下稳定性良好(表2)。

表2 人全血样品中环孢素A稳定性考察结果(n=5)

TDx法测定血药浓度精密吸取被检标本全血150 μl，放入离心管中，加入50 μl细胞溶解剂，再加入CsA蛋白沉淀剂300 μl，充分振荡后，离心，取上清液置TDxFLX仪器内，将CsA试剂盒放入仪器内进行测定。

统计学分析数据以均数±标准偏差表示，数据分析采用SPSS 17.0软件。分别用TDx法和HPLC法测得92例全血中CsA浓度，将TDx法测定的结果作为横坐标(X) ，HPLC法测定的结果为纵坐标(Y)，进行线性回归，评价两组数据的相关性。用配对t检验评价2种方法测定结果有无差异。通过计算 “(TDx法测定浓度-HPLC法测定浓度)/ HPLC法测定浓度×100％”的值来描述两种方法之间的关系。P<0.05为差异有统计学意义，P<0.01为统计学差异显著。

结 果

TDx法和HPLC法测定患者血中CsA浓度的相关性研究采集本院肾移植受者常规监测全血样本92例，分别用HPLC和TDx 两种方法同时进行测定(92例血样在不同的工作日采集并平行测定)。TDx法(X)与HPLC法(Y)测定的CsA血药浓度结果见图2。

图2 HPLC法和TDx法测定CsA血药浓度的相关性

对两种方法测定的结果进行线性回归分析，X与Y 的回归方程为Y=0.826X+8.318 ，r=0.9665，远大于不相关临界值，即两种方法有较好的相关性。用配对t检验评价两种方法测定结果是否存在差异，结果显示，在95％置信区间内两者在统计学上存在显著性差异(P<0.01)。通过计算 “(TDx法测定浓度-HPLC法测定浓度)/HPLC法测定浓度×100％”的均值可知，TDx法测定结果比HPLC法测定结果平均高出25.44％。

TDX法和HPLC法测定标准全血样品中CsA浓度的相关性研究取空白全血，按“标准曲线绘制”项下方法配制CsA低、中、高三个浓度(分别为80.0 ng/ml、400 ng/ml、2000 ng/ml)标准全血样品，分别用TDx和HPLC两种方法进行测定，每一浓度进行5个样本分析，用t检验评价两种方法测定结果是否存在差异(表3)。

表3 两种方法测定标准全血中环孢素A的结果(n=5)

以上结果显示，HPLC法测定结果与实际值较接近(RE<3％)，TDx法测定结果比HPLC法测定结果高出约10％，但低浓度时两组间无明显差异(P>0.05)，中、高浓度时两组间存在统计学差异(P<0.05)。

讨 论

CsA在血浆中与血浆蛋白和红细胞的结合率很高，且在红细胞和血浆中的分布受温度、细胞压积、药物浓度等多种因素影响。因此，必须采用全血样品进行测定，以保证测定结果准确、稳定。本试验建立了液液萃取处理血样和HPLC测定全血中CsA浓度的方法，采用重蒸乙醚作为萃取剂，减少了杂质的干扰。用NaOH溶液作为碱化剂，不仅可使与红细胞结合的CsA因溶血而易于提取入醚层，同时可使一些溶于碱液的杂质留在水相，但NaOH体积不可过大，否则水相比例过高，CsA提取回收率会降低。根据CsA微溶于正己烷的性质，采用正己烷洗涤来去除脂溶性杂质的干扰。正己烷在使用前应用乙腈预饱和，有利于分层，减少CsA的损失。此方法专属性强，灵敏度高，重现性好，且成本较低。

本研究发现，TDx法测的患者CsA全血药物浓度明显高于HPLC法测定结果(25.44％)(P<0.01)。将两种分析方法测定的结果进行相关性检验，结果表明两种方法测定CsA全血药物浓度相关性较好，与文献报道的结果一致[4,5]。用TDx和HPLC两种方法测定标准全血样品中CsA的浓度结果显示，HPLC法测定结果与实际值较接近(RE<3％)，TDx法测定结果偏离实际值较大(RE>7.5％)。低、中、高三个浓度测定结果均高于HPLC测定结果，低浓度时两种方法测定结果无明显差异，中、高浓度时两种方法测定结果差异显著，而测定患者血样时，TDx法测定结果比HPLC法测定结果高出25.44％。由此可知，TDx法测定结果，不只受CsA体内代谢产物及与药物交叉反应的影响，还可能存在其他的影响因素。 HPLC法提取、反复萃取的步骤较多，加上对红细胞的破坏，也可能是TDx法测定结果高于HPLC法的原因。

用HPLC法测定CsA血药浓度相对复杂费时，但成本较TDx法低。患者样品量少时，HPLC法可以作为测定CsA 的血药浓度的一个科学、准确、经济的测定方法，只是参考值比TDx偏低。样品量大时用TDx法测定CsA血药浓度较方便、省时。

小结：CsA各种检测方法所得结果存在很大差别，临床医师在分析CsA浓度结果时应该注意其检测方法，各实验室在报告检查结果时也应注明所用检测方法，以便临床医师对结果进行综合分析，准确调整患者用药剂量，使肾移植受者应用CsA剂量更为合理，以降低毒性反应和排斥反应。

1 王国俊，罗宏丽，张青碧，等．肾移植术后环孢素A血药浓度与患者血常规因素相关性分析 ．泸州医学院学报，2008，31(4)：382-384．

2 宋晓勇，张永州，王云香．HPLC法与荧光偏振免疫法检测血样中环孢素A浓度的比较研究．中国药房，2007，18(23)：1788-1789．

3 张 婷．HPLC法准确测定环孢素A的血药浓度．现代中西医结合杂志，2012，21 (10)：1095-1096．

4 章秀兰．血药浓度监测：高效毛细管电泳法检测血中环孢素A浓度．中国医学文摘：检验与临床，2005，19(3)：189-189．

5 刘文豹，刘 杰，刘 增．FPIA、RIA在环孢素A血药浓度监测中的对比分析．放射免疫学杂志，2008，21(5)：423-423．

6 王 波，李鹏飞，马 萍等．LC-MS/MS和荧光偏振法监测环孢素A血药浓度的相关性研究 ．质谱学报，2012，33(1)：28-31．

7 Schütz E,Svinarov D,Shipkova M,et al．Cyclosporin whole blood immunoassays (AxSYM,CEDIA,and Emit):a critical overview of performance characteristics and comparison with HPLC．Clin Chem,1998,44(10):2158-2164．

8 余自成，施新民，董永勤，等．AxSYM与TDx测定环孢素A血药浓度相关性．中国医院药学杂志，2004，24(12)：727-729．