响应面法优化马血中凝血酶原激活条件的研究

米丽班·霍加艾合买提，毛居代·亚尔买买提，热孜耶·喀日，热合满·艾拉，*

（1.新疆师范大学化学化工学院科研处，新疆乌鲁木齐830054；2.新疆师范大学生命科学学院，新疆乌鲁木齐830054；3.新疆农业大学食品科学与药学学院，新疆乌鲁木齐830052）

凝血酶（thrombin，EC3.4.21.5）是在血液凝固系统中起重要作用的丝氨酸蛋白水解酶，它是凝血酶原经凝血酶原激活物激活而成，具有较高的专一性，是近年来国内开发的一种新型速效局部止血药，临床上广泛应用于消化道出血和外科手术止血[1]。1939年从血清中分离凝血酶成功，用于肝脏实质性出血和骨髓出血止血取得显著效果。自上世纪80年代末，国内厂家相继开发成功，并广泛应用于临床各科[2]。制备凝血酶的原料多为牛（猪和人的血浆）。另外，还有从鸵鸟[3]和鲑鱼[4]的血液分离凝血酶的报道。我国是一个传统养马大国，有15个地方品种和11个培育品种，约占世界马品种的十分之一，存栏马匹达到790万匹，居世界之首[5]。凝血酶原本身没有活性，不能将纤维蛋白原转化为纤维蛋白。只有将其激活成凝血酶才有应用的价值。因此，这是凝血酶制备的关键一步[6]。生理条件下，凝血酶由凝血酶原在凝血因子Xa、凝血因子V、Ca+2和磷脂作用下激活生成。在缺乏某些激活因子的情况下，也能将凝血酶原转化为凝血酶，但是转化率很低[7]。本研究从食品安全的角度考虑，以响应面方法优化马血凝血酶原的激活工艺，考察激活条件对凝血酶比活力的影响，以其对动物血资源的综合开发利用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

马血 新疆华凌畜牧产业开发有限公司屠宰场或者华菱屠宰场；柠檬酸三钠、氯化钠、纤维蛋白原、凝血酶标准品、氯化钙、考马斯亮蓝G-250、牛血清蛋白、乙醇 皆为分析纯。

HH-54型数显恒温水浴锅 金坛市医疗仪器厂；TD5A＿WS型台式低速离心机 长沙湘仪离心机仪器有限公司；TU-1810型紫外可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司；PL203型电子天平 梅特勒托利仪器有限公司；DZKW-D-2型电热恒温水浴锅 北京市光明医疗仪器厂。

1.2 实验方法

1.2.1 马血浆的制备 取新鲜马血与3.8%柠檬酸三钠体积比为1∶7的溶液，搅拌均匀，以3000r/min的速度离心15min，除去红细胞，收集血浆，在-15℃条件下保存备用。

1.2.2 凝血酶原的制备 准确取50mL在4℃解冻的血浆置于烧杯中，以9倍体积的冷去离子水稀释，充分混匀，静置30min后，用1%醋酸调pH至5.1，5℃静置6h后，以3000r/min的速度离心15min，虹吸上清液，沉淀混合液溶于含0.9%NaCl、0.075%草酸钾溶液，搅拌溶解1h，3000r/min离心10min收集上清液，将此液过截留分子量为5ku的超滤膜，收集膜上部分。

1.2.3 单因素实验

1.2.3.1 激活时间对凝血酶比活力的影响 准确取5mL凝血酶原浓缩液液置于试管中，加入最终浓度为0.1mol/L CaCl2溶液，在30℃条件下，分别选取不同的激活时间：0.5、1.5、2.5、3.5、4.5h，测蛋白质的浓度和酶的活力。

1.2.3.2 激活温度对凝血酶比活力的影响 准确取5mL凝血酶原浓缩液液置于试管中，加入最终浓度为0.1mol/L CaCl2溶液，分别在10、20、30、40、50℃条件下激活2.5h，测蛋白质的浓度和酶的活力。

1.2.3.3 Ca2+浓度对凝血酶比活力的影响 准确取5mL凝血酶原浓缩液液置于试管中，分别加入最终浓度为0.07、0.10、0.13、0.16mol/L CaCl2溶液，在30℃条件下激活2.5h，测蛋白质的浓度和酶的活力。

1.2.4 响应面法优化提取条件 为了优化凝血酶原激活工艺条件，以凝血酶比活力为响应值，选取激活时间、激活温度、Ca2+浓度做单因素实验；在单因素实验的基础上，根据Box-Behnken中心组合实验设计原理，采用三因素三水平的响应面分析法进行实验设计，确定马血中凝血酶原激活的最佳工艺条件，实验因素与水平见表1。

表1 响应面实验设计Table 1 Factors and levels of response surface analysis

1.2.5 蛋白质含量测定 考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量[8]。

1.2.6 凝血酶活力测定 参照钟峻等[9]的方法。准确取纤维蛋白原0.125g，加入100mL 0.9%NaCl溶液（pH7.17），配制成纤维蛋白原溶液，并置于10支离心管内，4℃下保存备用。取凝血酶标准品，用0.9%NaCl溶液分别制成每1mL中含5.0、6.4、8.0、10U的标准品溶液。另取试管4支，各精密加入纤维蛋白原溶液0.9mL，置37℃水浴中保温5min，再分别精密量取上述4种浓度的标准品溶液各0.1mL，迅速加入上述各试管中，摇匀，立即计时，置37℃水浴中，观察纤维蛋白的初凝时间，每种浓度测5次，求平均值。在双对数坐标纸上以标准品效价（单位）为横坐标，凝结时间（秒）为纵坐标，计算回归方程。凝血酶比活力计算公式如下：

1.2.7 数据处理 利用统计分析Design-Expert软件进行数据处理。

2 结果与分析

2.1 凝血酶的标准曲线

利用凝血酶催化纤维蛋白原凝固的原理测定其活性。酶活性单位定义：每分钟催化转变反应体系中的1μmol底物的酶量为一个国际单位（U）。

图1 凝血酶标准曲线Fig.1 Standard curve of thrombin

2.2 单因素实验

2.2.1 激活时间对凝血酶比活力的影响 由图2可知，随着激活时间的延长，凝血酶比活力先增大后减小，这可能与环境有关系，说明马凝血酶是不太稳定的，激活时间为2.5h时比活力达到最高值，激活时间超过2.5h酶活损失较多，因此激活时间选择2.5h。

图2 激活时间对凝血酶比活力的影响Fig.2 Effect of activating time on specific activity of thrombin

2.2.2 激活温度对凝血酶比活力的影响 由图3激活温度对凝血酶比活力的影响可知，随着激活温度的升高，凝血酶比活力缓慢增加，当激活温度为30℃时，凝血酶比活力达到最高值，继续增大激活温度，酶活力降低，这可能是因为马血凝血酶不耐热，在较高的温度导致其失活。因此实验中选择温度为30℃。

图3 激活温度对凝血酶比活力的影响Fig.3 Effect of activating temperature on specific activity of thrombin

图4 Ca2+浓度对凝血酶比活力的影响Fig.4 Effect of Ca2+concentration on specific activity of thrombin

2.2.3 Ca2+浓度对凝血酶比活力的影响 由图4可知，随着Ca2+浓度的增加，凝血酶比活力逐渐增加，当最终浓度超过0.10mol/L时，凝血酶比活力趋于下降，这说明Ca2+浓度超过一定范围时，同样会导致提取液中凝血酶的变性失活，并且加入过多的Ca2+对后续的处理造成很大的麻烦，综合考虑选择Ca2+浓度为0.1mol/L。

2.3 响应面法优化实验

在单因素实验的基础上，根据Box-Behnken中心组合实验设计原理，采用三因素三水平的响应面分析法进行实验设计，所得结果见表2。

表2 响应面设计方案与实验结果Table 2 Design and results of response surface analysis

2.4 数学模型的建立

根据表2所得的实验数据，采用响应面统计方法对实验数据拟合，建立凝血酶比活力与激活时间、激活温度、Ca2+浓度三因子的二次多项数学回归方程：

Y=51.48+0.83×A+0.62×B+1.86×C+0.032×A×B-0.018×A×C-0.11×B×C-2.06×A2-1.33×B2-4.13×C2

回归模型方差分析见表3，模型的p=0.0002＜0.01，说明对马血凝血酶建立的回归模型是极显著的，失拟项p=0.9937＞0.05不显著，相关系数R2=0.9683，表示模型的拟合度良好，实验误差较小。可以选用此模型对凝血酶原的激活工艺进行分析和预测。同时，对所考察因素的显著性排序为：C＞A＞B。虽然交互项的显著性并不明显，但它们二次项具有显著性，可以确定此模型是合适的。激活时间，激活温度对凝血酶比活力的影响显著（p＜0.05），Ca2+浓度对凝血酶比活力的影响极显著（p＜0.01）。

表3 回归模型方差分析Table 3 Analysis of variance in regression model

2.5 响应面分析与优化

图5为0.1mol/L Ca2+时，激活时间与激活温度的交互作用对凝血酶比活力的影响曲面。由图5可知激活时间1.5～3.5h时，凝血酶比活力先增大后减少，2.81h时达到最大值；激活温度20～40℃时，凝血酶比活力也先增大后减少，温度在32.35℃时达到最大值。

图5 Y=（A，B）以凝血酶比活力为响应值的等高线及响应面图Fig.5 Response surface plot and contour map plot in reponse to thrombin for Y=（A，B）

图6为激活温度在30℃时，激活时间与Ca2+浓度的交互作用对凝血酶比活力的影响曲面。由图6可知激活时间1.5～3.5h时，凝血酶比活力先增大后减少，2.81h时达到最大值；Ca2+浓度在0.07～0.13mol/L时，凝血酶比活力先增大后减少，Ca2+浓度为0.11mol/L时达到最大值。

图6 Y=（A，C）以凝血酶比活力为响应值的等高线及响应面图Fig.6 Response surface plot and contour map plot in reponse to thrombin for Y=（A，C）

图7为激活时间为2.5h时，激活温度与Ca2+浓度的交互作用对凝血酶比活力的影响曲面。由图7可知激活温度20～40℃时，凝血酶比活力先增大后减少，温度在32.35℃时达到最大值；Ca2+浓度在0.07～0.13mol/L时，凝血酶比活力先增大后减少，Ca2+浓度为0.11mol/L时达到最大值。

图5～图7是以凝血酶比活力为响应值响应曲面图，通过对相应的等高线及响应曲面分析，由Design-Expert软件给出响应图的预测值，凝血酶比活力为50.5274U/mg，其对应的工艺参数是：激活时间2.81h、激活温度32.35℃、Ca2+浓度为0.11mol/L。校正理论水平分别为激活时间2.8h、温度32℃、Ca2+浓度0.11mol/L，在此条件下做3组平行实验，以检验模型的准确性。所得的凝血酶比活力分别为51.63、52.05、49.81U/mg，平均值为51.16U/mg。验证值和预测值非常接近，说明回归方程可以较真实的反映各筛选因素的影响，建立的模型与实际情况比较吻合，再次证明该回归模型的可行性。

图7 Y=（B，C）以凝血酶比活力为响应值的等高线及响应面图Fig.7 Response surface plot and contour map plot in reponse to thrombin for Y=（B，C）

3 结论

马血凝血酶原激活条件，利用实验设计软件Design-Expert，通过响应面分析法建立马血凝血酶原激活工艺的数学回归模型，并对各因子对凝血酶比活力的影响进行了分析，得出影响马血凝血酶原激活的各因素顺序依次为：Ca2+浓度＞激活时间＞激活温度；马血凝血酶原激活工艺的最佳参数为：激活时间2.8h、激活温度32℃、Ca2+浓度0.11mol/L，凝血酶比活力为51.16U/mg。

[1]欧伶，宋聿文.猪凝血酶原的制备[J].中国医药工业，1997，28（10）：435-438.

[2]庄秀华.局部止血药-凝血酶简介[J].海峡药学，2002，14（5）：93-94.

[3]Carminita Frost，Ryno Naude.Purification and characterization of ostrich prothrombin[J].The International journal of Biochemistry&Cell Biology，2000（32）：1151-1159.

[4]Sarah E Michaud，louise Z Wang.Purification of salmon thrombin and its potential as an alternative to mammalian thrombins in fibrin sealants[J].Thrombosis Rsearch，2002，107：245-254.

[5]韩国才.我国马业的新趋势[J].中国动物保健，2005（10）：26.

[6]李征，熊祥政.人凝血酶的制备[J].华西药学杂志，1998，13（4）：253-255.

[7]Macgregor.United states patent：US，5907032[P].1999-5-25.

[8]乌云达来，孙振钧，王冲，等.牛血铜锌超氧化物岐化酶规模化生产工艺研究[J].家畜生态学报，2006，27（5）：46-52.

[9]钟峻，印文考，林缨，等.高纯度人凝血酶的制备[J].中国医学科学院学报，1995，17（1）：36-40.

[10]Montgomery.Design and analysis of experiments[M].6th Edition.傅珏生译.北京：人民邮电出版社，2009（1）：347-389.