羊奶脂肪酶特性的研究

贾润芳，张富新，杨吉妮，张 怡，李龙柱，晏慧莉，陈 雪，马婷婷

（陕西师范大学食品工程与营养科学学院，陕西西安710062）

羊奶营养丰富，富含蛋白质、脂肪、乳糖、矿物质以及多种维生素，其化学组成接近人奶[1]，被营养学界誉为“贵族奶”[2]。但羊奶具有膻味，限制了羊奶及其产品的消费。目前研究表明，羊奶膻味主要由奶中低级挥发性脂肪酸较高引起的，尤其是羊奶中的游离脂肪酸（FFA）[3-4]。奶中的FFA是在脂肪酶的作用下，催化乳脂肪降解形成的。乳中的脂肪酶主要来源于两个方面，一方面源于乳中微生物污染，尤其是一些嗜冷菌分泌的脂肪酶[5]，这些脂肪酶通常具有一定的耐热性，在63℃/30min的巴氏杀菌条件下仍能存活[6]，而这些微生物脂肪酶在实际生产中只要严格控制原料乳卫生质量是能够得到控制的。乳中脂肪酶的另一个来源是乳中固有的脂肪酶，在刚分泌的乳中就存在，尤其在原料乳贮存过程中，对脂肪降解具有重要作用[7]，能够引起乳脂肪的自发降解[8]。目前，人们发现乳中的固有脂肪酶主要来源于乳中的脂蛋白脂酶（Lipoprotein lipase，LPL）[7]，存在于乳清、酪蛋白和乳脂肪球表面，其分布比例在不同乳类中有一定差别[9]，羊奶中LPL主要分布在乳清和乳脂肪球中。国内外大量研究都是在牛奶中进行[5-7，10-12]，对于羊奶中脂肪酶的特性没有系统的报道，并且LPL对乳脂肪的分解程度与环境温度、pH以及金属离子密切相关[10]，因此本文对影响羊奶中脂肪酶活性的温度、pH以及金属离子进行研究，以便为提高羊奶产品质量品质，脱除羊奶膻味提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

羊奶 来自陕西富省富平县关中奶山羊合作社的20只关中奶山羊，采用手工挤奶，挤奶前用干净毛巾对乳房清洗，为防止微生物污染，挤奶时弃去前3把奶（约20mL），然后用预先灭菌的取样管收集奶样，每只羊收集20mL乳样，共收集20个奶样，然后混合成混合样，送到实验室，在-40℃下冷冻备用，测定时在4℃冰浴中溶解；乙二胺四乙酸二钠（Ethylene Diamine Tetra Acetic Sodium，EDTA）、巴比妥钠（Barbitone sodium）、对硝基苯基丁酸酯（p-Nitrophenyl butyrate）、苯甲基磺酰氟（Phenyl-methane Sulphonyl Fluoride，PMSF）、乳品澄清剂（Clarifying Reagent for Dairy Products）、对硝基苯酚（p-nitrophenol） Sigma公司；二甲基磺酰胺（Dimethylformamide，DMF） 天津市天力化学试剂有限公司；乙腈 天津市富宇精细化工有限公司；以上试剂 均为分析纯。

TU-1810型紫外可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司；雷磁pHS-3C型精密pH酸度计 上海精密科学仪器有限公司；XMTD数显恒温水浴锅 上海福玛实验设备有限公司；移液枪（100-1000μL） 上海荣泰生化工程有限公司；CS1012型电热鼓风干燥箱 重庆实验设备厂；玻璃仪器烘干器 郑州长城科工贸有限公司；KQ3200B型超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司；电子天平 梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 脂肪酶活性的测定 采用Humbert[13]的方法测定。取0.5mL的奶样与2mL巴比妥钠（0.05mol/L pH7.6）缓冲液混合，37℃水浴保温10min，加入50μL对硝基苯酚丁酸酯溶液，充分振荡后，37℃水浴中保温10min，添加400μL的混合抑制剂（0.06mol/L pH7.6的EDTA与苯甲基磺酰氟的体积比为3∶1），在37℃水浴保温10min，加入2mL乳品澄清剂，振荡使样品澄清，在37℃水浴中保温3～5min，在15min内用紫外分光光度计，在412nm下测定吸光度。然后用对硝基苯酚标准曲线计算脂肪酶活性。

脂肪酶活性定义为，1mL乳样在1min内生成1μmol对硝基苯酚所需要的酶量为1个活性单位（U）。计算公式为：

脂肪酶活性（U）=A/（B·T）

式中：A表示体系中产生的对硝基苯酚的量（μmol）；B表示乳样体积（mL）；T表示酶作用的时间（min）。

脂肪酶相对活性按下式计算：

相对酶活（%）=测定酶活性/最大酶活性×100

1.2.2 标准曲线的绘制 甲液的配制：精确称取0.139g对硝基苯酚，加入2mL巴比妥钠（0.05mol/L pH7.6）缓冲溶液、400μL混合抑制剂（0.06mol/L pH7.6的EDTA与苯甲基磺酰氟的体积比为3∶1）和2mL的乳品澄清剂，用乙腈定容至100mL，得到10mmol/L的对硝基苯酚溶液。乙液的配制：用吸管吸取2mL巴比妥钠缓冲溶液、400μL混合抑制剂和2mL乳品澄清剂于100mL的容量瓶中，用乙腈定容至100mL，得到乙液稀释液。将甲液用乙液稀释液进行稀释，得到不同浓度（0、10、20、30、40、50、60、70μmol/L）的对硝基苯酚溶液，412nm处测吸光度值，绘制标准曲线。

1.2.3 脂肪酶最适温度的测定 将1.2.1实验方法中的温度分别保持在25、30、35、37、40、45、50、55、60、65、70℃，并将pH调节到6.5，然后测定脂肪酶的活性。

1.2.4 脂肪酶热稳定性的测定 在pH为6.5的条件下，将乳样分别在40、50、60、70、80、90℃水浴中保温10、30、60、90、120、180min后，然后测定其脂肪酶活性。

1.2.5 脂肪酶最适pH的测定 在25℃的条件下，用0.1mol/L的HCl或0.1mol/L的NaOH将乳样的pH调整到4.0、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，然后测定其脂肪酶的活性。

1.2.6 脂肪酶pH稳定性的测定 用0.1mol/L HCl或0.1mol/L NaOH将乳样pH调整到5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5，然后在25℃下放置30、60、90min，测定脂肪酶的活性。

1.2.7 金属离子对脂肪酶活性影响的测定 在乳样中分别加入浓度为100mmol/L的CaCl2、ZnSO4、NaCl、Al2（SO4）4、FeSO4、Fe3（SO4）2、CuSO4、K2SO4、MnSO4、MgSO4，使其在羊奶中金属离子的浓度分别达到5mmol/L和10mmol/L，在25℃下放置30min后，测定其脂肪酶的活性。

1.3 数据的处理

数据采用Excel、DPS软件进行差异性分析。

2 结果与分析

2.1 对硝基苯酚标准曲线

图1 对硝基苯酚标准曲线Fig.1 The standard curve of p-nitrophenol

由图1可见，对硝基苯酚浓度与吸光度值呈线性关系，回归方程为y=0.02x+0.0131，R2=0.9996。式中，x表示对硝基苯酚浓度，y表示412nm处的吸光度值，0.9996为标准曲线的线性相关系数。由此可知，测定对硝基苯酚浓度在0～70μmol/L范围内，具有良好的线性关系。

2.2 脂肪酶的最适温度

图2 温度对羊奶中脂肪酶活性的影响Fig.2 Effect of temperature on lipase activity in goat milk

从图2可以看出，在25～37℃之间，羊奶中脂肪酶活性随温度升高逐渐提高（p＜0.05）；在37℃时，脂肪酶活性达到最高；当温度大于37℃时，随着温度的升高脂肪酶活性显著性降低（p＜0.05），温度达到70℃时，脂肪酶活性仅为0.23U。酶促反应与温度密切相关，酶活性达到最高时的温度称为酶的最适温度。酶是一种活性蛋白质，当温度过高时，酶蛋白遇热变性，活性降低，甚至失活。Jandal[10]和Harper[14]研究发现当热处理强度较大时，脂肪酶活性降低；Jandal[15]报道乳中的脂肪酶最适温度为37℃，这与本研究中脂肪酶最适温度一致。

2.3 脂肪酶的热稳定性

图3 脂肪酶的热稳定性Fig.3 Heat stability of lipase in goat milk

从图3可以看出，在40℃保温过程中，羊奶中脂肪酶活性无明显变化（p＞0.05）；在50℃保温180min时，脂肪酶活性略有下降（p＞0.05），仍保持较高的活性；但当热处理温度大于60℃时，脂肪酶活性显著（p＜0.05）下降，在60℃保温60min时，羊乳中脂肪酶活性迅速降低，残余活性仅为处理前的40%。在70℃以上处理90min时，脂肪酶活性几乎丧失。由此可见，羊乳中的脂肪酶在热处理温度低于50℃时具有较好的热稳定性，随着热处理温度的升高，脂肪酶热稳定性降低。乳中脂肪酶活性不仅与热处理温度有关，同时与热处理时间密切相关，Law[16]研究表明，乳在63℃下处理30min时，脂肪酶仍然有55%～100%的活性，在65℃下20min时脂肪酶完全失活[17]，由此可见，热处理温度是影响羊乳中脂肪酶活性的主要因素。

2.4 脂肪酶的最适pH

图4 pH对脂肪酶活性的影响Fig.4 Effect of pH on the lipase in goat milk

由图4可以看出，当羊乳pH小于6.5时，随着pH的增大，脂肪酶活性逐渐增高（p＜0.05）；当pH大于6.5时，随着pH的增大，脂肪酶活性逐渐降低（p＜0.05）；当pH为6.5时，羊奶脂肪酶活性最高。由此可见，羊乳中脂肪酶的适宜pH在6.0～7.0之间，其最适pH为6.5。Hess[18]研究认为乳中脂肪酶最适pH为6.5，与本研究中羊奶脂肪酶最适pH一致。

2.5 脂肪酶的pH稳定性

图5 脂肪酶的pH稳定性Fig.5 pH stability of lipase in goat milk

从图5可以看出，随着处理时间的延长，除pH5中的60min比30min活性略高以外，羊奶中脂肪酶活性均呈下降的趋势（p＞0.1），但在不同pH下处理相同时间时，脂肪酶活性下降程度有所差异。在pH5.0～6.5处理时，脂肪酶活性下降程度较小，在pH5.0时，处理60min时，脂肪酶活性仅降低20%；在pH6.5时处理60min时，脂肪酶活性下降17%；然而在pH7.0时，处理60min，脂肪酶活性下降60%。由此可见，羊奶脂肪酶在pH5.0～6.5范围内具有较高稳定性。Dharmsthiti[19]报道乳中脂肪酶在pH6.0～8.0较稳定，与本研究中羊奶中脂肪酶pH稳定性基本一致。pH可引起酶蛋白质电荷的变化，从而影响酶稳定性，在一定pH范围内，酶蛋白带有一定的电荷，表现出较高的活性。同时pH过高或过低都会影响酶构象的变化，从而影响酶与底物的结合能力[20]。

2.6 金属离子对脂肪酶活性的影响

表1 金属离子对于脂肪酶相对活性的影响（%）Table 1 Effect of metal ion on the relative activity of lipase in goat milk（%）

由表1可以看出，不同金属离子对羊奶中脂肪酶活性具有不同的影响。在羊奶中添加Ca2+、Fe2+可明显提高乳中脂肪酶的活性；添加K+、Zn2+、Cu2+、Mn2+和Mg2+可使乳中脂肪酶的活性降低；而在羊乳中添加Na+时，羊奶中的脂肪酶活性几乎无明显变化。表明Ca2+、Fe2+对羊奶中脂肪酶具有激活作用，而K+、Zn2+、Cu2+、Mn2+和Mg2+对脂肪酶具有抑制作用。同时发现在羊乳中添加5mmol/L的Al3+和Fe3+时脂肪酶活性降低，而添加10mmol/L的Al3+和Fe3+时脂肪酶的活性升高，表明低浓度的Al3+和Fe3+对脂肪酶活性具有抑制作用，而高浓度的Al3+和Fe3+对脂肪酶具有激活作用。金属离子对脂肪酶活性的影响可能与金属离子参与酶的辅基有关[21]。Rathi[22]研究表明，Ca2+可激活脂肪酶；Hess[18]和Metin[23]的研究也证明了，Zn2+、Cu2+对脂肪酶有抑制作用；Tao[24]的研究认为，Mn2+对脂肪酶有一定的激活作用。不同金属离子对酶的结构和功能所起的作用不相同。金属离子可能是通过结合于酶活性部位影响酶的构象与活力[25-26]。对于金属离子浓度，在低浓度时，金属离子通过非特异性的静电相互作用，而在较高的浓度，金属离子可影响脂肪酶结构稳定性的特异效应，并且高浓度金属离子通常对酶的结构稳定性产生不利的影响[27]。

3 结论

通过对影响羊奶脂肪酶活性的温度、pH和金属离子的研究表明，羊奶中脂肪酶在37℃时具有较高活性，且在40～50℃时具有较高的热稳定性，在温度大于70℃时，脂肪酶活性损失较大；羊奶脂肪酶受pH影响较大，在pH6.5时具有较高活性，且在pH5.0～6.5时稳定性较高；不同金属离子对羊奶脂肪酶也有一定的影响，Ca2+和Fe2+对羊奶中脂肪酶具有激活作用，而K+、Zn2+、Cu2+、Mn2+和Mg2+对脂肪酶具有抑制作用，低浓度的Al3+和Fe3+对脂肪酶活性具有抑制作用，而高浓度的Al3+和Fe3+对脂肪酶具有激活作用。

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