源自合作藏区优良乳酸菌的酸奶发酵剂发酵条件优化

秦 虹，梁 琪，张卫兵，张 炎，米 兰

（1.甘肃农业大学食品科学与工程学院，甘肃兰州730070；2.甘肃省功能乳品工程实验室，甘肃兰州730070）

酸奶因其丰富的营养价值、良好的保健功能以及特殊的口感，越来越受到广大消费者的青睐，但其品质受发酵剂、发酵条件等因素的影响[1]。若发酵剂产酸过快，会使酸奶质地粗糙、黏度降低并析出大量的乳清，且在贮藏过程中活菌数下降、后酸化增强，从而影响酸奶的货架期；若发酵剂产酸过慢，会使酸奶的发酵时间延长，产酸不足，导致酸奶的品质变差[2-3]。而发酵条件决定了发酵剂的产酸速率、凝乳时间、酸奶的组织状态及风味的形成等[1，4]。商业上常用的发酵剂一般由嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌组合而成，在酸奶发酵过程中它们的相互关系会表现为拮抗作用和协同作用[5]。对菌株进行组合发酵主要是利用菌株间的协同作用，使其代谢产物相互利用，促进生长，提高产酸速率，增强酸化能力，减弱后酸化能力，促进风味物质和更多胞外多糖的产生等，使各菌株的优势在产品中一起表现出来[6]。发酵条件会直接影响发酵成品酸奶的品质，这些发酵条件主要有发酵温度、发酵剂的接种量、球杆菌的复配比例和蔗糖的添加量[7]。发酵温度、发酵剂的接种量和复配比例对菌体的酸化能力、后酸化能力及胞外多糖的产生等有影响，从而对产品的品质产生影响；蔗糖添加量会影响产品的风味[8]。因此，用从合作藏区传统发酵牦牛乳中分离筛选并经鉴定的嗜热链球菌Q4和保加利亚乳杆菌G4混菌发酵酸奶，对其发酵条件进行优化，可以为菌株的工业化应用提供理论依据，并为自主知识产权的酸奶发酵剂研发奠定基础。

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也许是动作太快，等这一切结束时，周教授几个还张着大嘴愣怔着。只有可蔓不惊不慌，正像一个长官似地在那教训一个长着娃娃脸的八路军。可蔓拍着娃娃兵的帽子说，是不是新兵蛋子嘛，怎么连驳壳枪都不会打嘛，要平端着打知道不？

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

嗜热链球菌Q4（Streptococcus thermophilus）、保加利亚乳杆菌G4（Lactobacillus bulgaricus） 均由甘肃省功能乳品工程实验室保藏，分离自合作藏区传统发酵乳中；脱脂乳 黑龙江完达山乳业。

SW-CJ-2FD超净工作台 苏州净化设备有限公司；YX-280手提式压力蒸汽灭菌锅 上海三申医疗器械有限公司；HG303-4电热恒温培养箱 南京实验仪器厂；PB-203电子天平 Mettler-Toledo公司；pHS-25数显pH计 上海精密科学仪器厂；LVDV-1旋转式数显粘度计 上海精密科学仪器有限公司。

表1 发酵乳感官评价表Tabel 1 The score table for sensory evaluation of fermented milk

1.2 实验方法

1.2.1 指标的测定

1.2.1.4 活菌数的测定 将凝固后的发酵乳置于4℃冷藏24h后，将样品放置至室温，吸取1mL进行梯度稀释，选取合适的梯度稀释液涂布于MRS的固体培养基上，在37℃下培养2d，进行菌落计数[10]。

1.2.2.4 最佳菌种复配比例的确定 活化好的菌株按1∶2、2∶2、3∶2、4∶2、5∶2的（球∶杆）比例，3%的接种量接种于含6%（g/mL）蔗糖的灭菌脱脂乳中，置于37℃培养，记录凝乳时间，测定酸度、黏度和活菌数并进行感官评价。

宝宝的性格是通过什么渠道形成的呢？性格是一个人对客观现实的稳固态度和惯常的行为方式，是人与人、人与环境相互作用的结果。虽然先天气质对人的性格有一定的影响，但是性格主要是在后天形成的。

1.2.1.3 黏度的测定 将凝固后的发酵乳置于4℃冷藏24h后，用LVDV-1型黏度计在4℃测定其黏度，单位为Pa·s[9]。

通过以下例句，学生可归纳出when，where和why以及“介词+which”如何实现与先行词的照应。

1.2.1.1 凝乳时间 将活化好的菌株按一定的比例接种到12%灭菌脱脂乳中，在适当的温度下发酵至凝乳，记录凝乳时间。

1.2.1.5 感官评价 将凝固后的发酵乳置于4℃冷藏24h后，由7个感官评价专家对样品的色泽和滋味、组织状态等指标进行综合评价[11-13]。

1.2.2.1 最佳发酵温度的确定 活化好的菌株按1∶1（球∶杆）的比例，3%接种量接种于含6%（g/mL）蔗糖的灭菌脱脂乳中，置于31、34、37、40、43℃发酵，记录凝乳时间，测定酸度、黏度和活菌数并进行感官评价。

1.2.2 单因素实验

风险匹配制度是指商业银行只能向客户销售风险评级等于或低于其风险承受能力评级的理财产品。2011年颁布的《商业银行理财产品销售管理办法》（以下简称为《办法》）明确规定商业银行销售理财产品应当遵循风险匹配原则，禁止误导客户购买与其风险承受能力不相符合的理财产品。然而，因为缺乏风险匹配制度的具体实施细则，风险测评的可操作性差，容易造成商业银行对理财产品的风险评级和对投资者的风险承受能力的评级流于形式，误导投资者购买高于其风险承受能力的理财产品。

2.1.4 最佳复配比例的确定 在酸奶生产中，通常将球、杆菌复配发酵酸奶，杆菌的对产酸起主导作用，而球菌通常具有较强的凝乳作用，但是在发酵剂中杆菌的比例较大时，发酵剂的后酸化能力强，对产品的品质产生影响[1]。

1.2.2.2 最佳蔗糖添加量的确定 活化好的菌株按1∶1，3%接种量接种于含 4%、5%、6%、7%、8%（g/mL）蔗糖的灭菌脱脂乳中，置37℃培养，记录凝乳时间，测定酸度、黏度和活菌数并进行感官评价。

1.2.1.2 滴定酸度的测定 根据GB/T 5413.34-2010方法进行测定。

1.2.3 最佳发酵条件的优化 基于单因素实验，选取因素与水平，以感官评价评分值为响应值，通过Box-Behnken实验设计对发酵条件进行优化[14-16]。

表2 Box-Behnken实验设计因素水平表Table 2 Experimental level and code of variables chosen of Box-Behnken

1.2.4 数据统计分析 采用SPSS 17.0软件对实验数据进行统计分析。

教师是太阳底下最光辉的职业，也是最平凡的职业。“吃也清淡，穿也素雅，心怀淡泊，起始于辛劳，收结于平淡”，这正是教师的人生写照。学生的每一次成长和进步都会给教师带来巨大的欣慰，驱散生活中的阴霾，激励着我们不断启程、向前。每位教师都应该努力追求成为一名真正的“人师”，做好学生的引路人，为实现伟大而灿烂的中国梦添砖加瓦。

2 结果与讨论

2.1 单因素实验

2.1.1 最佳发酵温度的确定 从表3可知，随着发酵温度的增大，酸奶的凝乳时间缩短，说明温度越高，产酸速率越大，达到发酵终点的时间越短[17]；滴定酸度逐渐增大；黏度呈现先增大后减小的趋势，其他温度下发酵的酸奶的黏度显著的高于43℃（p＜0.05），与John A[17]的研究报道相一致。活菌数呈现逐渐减小的趋势，是因为较低的温度有利于菌体生长[18]。在不同发酵温度条件下，酸奶感官评价评分差异显著（p＜0.05），40℃发酵时，酸奶的感官评价评分明显高于其他实验组，呈微黄色，组织状态细腻光滑，且无乳清析出。因此，40℃为最佳发酵温度。

2.1.2 最佳蔗糖添加量的确定 不同的蔗糖添加量可以调节酸奶最终的酸甜比，使酸奶的风味有所改善。从表4可知，在不同的蔗糖添加量下，凝乳时间、滴定酸度、黏度差异不显著（p＞0.05），因此，不同的蔗糖添加量对凝乳时间、滴定酸度、黏度没有影响，这与王攀[8]的研究结果一致。活菌数呈现先增大后减小的趋势，5%蔗糖添加量时，活菌数最高，为9.66lg CFU/mL。5%蔗糖添加量时酸奶中的活菌数与8%蔗糖添加量时差异显著（p＜0.05），其他实验组之间差异都不显著（p＞0.05）。不同的蔗糖添加量对酸奶的感官评价评分影响显著，当加糖量为5%时，感官评价评分显著的高于其他实验组（p＜0.05），酸甜比例适中，风味最佳；当蔗糖添加量为4%，酸奶酸味较重；当蔗糖添加量为6%、7%、8%时，酸奶甜味较重。因此，5%为最佳蔗糖添加量。

表3 发酵温度的确定Table 3 Determination of the fermentation temperature

表4 蔗糖添加量的确定Table 4 Determination of the addition of suger

表5 接种量的确定Table 5 Determination of the inoculation rate

表6 菌种复配比例的优化结果Table 6 Determination of the mixing ratio for strains

2.1.3 最佳接种量的确定 发酵剂接种量过低，产酸速率较慢，使酸奶的凝乳时间延长，影响产品的最终品质；接种量过高，产酸速率加快，使酸奶的凝乳时间缩短，但酸味较重、组织状态较差且有大量的乳清析出[19]。从表5可知，随着接种量的增大凝乳时间缩短，滴定酸度增大，活菌数增大，且他们差异都显著（p＜0.05）。黏度呈现先增大后减小的趋势，3%接种量时，黏度达最大，为7.96Pa·s，与4%接种量差异不显著（p＞0.05），与其他实验组差异显著（p＜0.05）。发酵剂接种量对酸奶的感官评价评分影响显著（p＜0.05），当发酵剂接种量3%时，酸奶组织状态细腻，表面光滑，无乳清析出，且感官评价评分显著高于其他实验组（p＜0.05）。因此，3%为最佳发酵剂接种量。

1.2.2.3 最佳接种量的确定 活化好的菌株按1∶1，1%、2%、3%、4%、5%的接种量接种于含6%（g/mL）蔗糖的灭菌脱脂乳中，置于37℃培养，记录凝乳时间，测定酸度、黏度和活菌数并进行感官评价。

美团点评 CEO王兴曾说过，“按每人一顿饭10元计算，一年在餐饮上的消费至少1万元。作为一门入口的生意，14亿人带来的就是14万亿元的市场。”

从表6可知，在不同复配比例的条件下，凝乳时间和活菌数差异不显著（p＞0.05）。滴定酸度差异显著（p＜0.05），随杆菌比例的增大而增大。这一结果与Cais-sokolinska D[20]的报道是一致的。复配比例对酸奶的黏度有一定的影响，随着嗜热链球菌比例的增大而增大，混合菌中嗜热链球菌体积分数较高时更利于黏性物质的产生[21]。当复配比例为1∶1时，产品组织状态良好，口感光滑细腻，酸甜比例适中，风味最佳，且感官评价评分显著的高于其他实验组（p＜0.05）。因此，1∶1为菌种的最佳复配比例。

由表6模型回归结果可知，在95%的置信区间下，X 2，X 3，X 4，X 5，X 6的 T统计量所对应的 P值均小于0.01，即国内市场规模，年平均汇率，婴幼儿配方乳粉的进口平均价格，国产产品和进口产品的抽检合格率都是影响婴幼儿配方乳粉进口量的显著因素。根据回归结果可以得出以下方程：

2.2 最佳发酵条件优化

基于单因素实验结果，用Box-Benhnken实验设计对其进行优化，实验结果见表7。

表7 Box-Benhnken实验设计及及响应值结果Table 7 Test design and results of Box-Benhnken

利用Design Expert 8.0拟合实验结果得到回归方程：

通过分析回归系数可知各因素影响感官评价评分的主次顺序为：发酵温度＞蔗糖添加量＞接种量＞复配比例。对该回归方程进行方差分析，结果见表8。从表8可知，发酵温度、蔗糖添加量对响应值的影响极显著（p＜0.01），接种量对响应值影响显著（p＜0.05），表明这3个因素对感官评价评分的线性效应显著；所有因素的二次项对响应值的曲面效应极显著（p＜0.01）；蔗糖添加量和接种量的交互作用对响应值的影响极显著（p＜0.01），表明各影响因素对感官评价的影响不是简单的线性关系。该模型达到极显著水平（p＜0.001），方程的失拟项不显著（p=0.2920），模型选择合适。其校正决定系数（R2Adj）为0.9566，说明此模型对实验拟合度较高。

表8 Box-Benhnken实验方差分析Table 8 Analysis of variance for Box-Benhnken

根据回归方程绘制响应面图（见图1～图6），考察所拟合的响应曲面的形状，分析发酵温度、蔗糖添加量、接种量、复配比例对感官评价评分的影响。从响应面的最高点可以看出，在所选的范围内存在极值，即为响应面的最高点。

图1 发酵温度和蔗糖添加量对感官评价评分影响的响应面图Fig.1 Effect of the fermentation temperature and amount of suger on sensory evaluation score

从图1～图6可以看出，发酵温度和蔗糖添加量是影响感官评价的重要因素，接种量次之，复配比例影响不大。从图4可以看出，当发酵温度和复配比例为中心水平时，蔗糖添加量和接种量的交互作用对感官评价的影响极显著。其他因素的交互作用对响应值影响不大。

图2 发酵温度和接种量对感官评价评分影响的响应面图Fig.2 Effect of the fermentation temperature and inoculation rate on sensory evaluation score

图3 发酵温度和复配比例对感官评价评分影响的响应面图Fig.3 Effect of the fermentation temperature and mixing ratio on sensory evaluation score

图4 蔗糖添加量和接种量对感官评价评分影响的响应面图Fig.4 Effect of the amount of suger and inoculation rate on sensory evaluation score

图5 蔗糖添加量和复配比例对感官评价评分值影响的响应面图Fig.5 Effect of the amount of suger and mixing ratio on sensory evaluation score

图6 接种量和复配比例对感官评价评分影响的响应面图Fig.6 Effect of the inoculation rate and mixing ratio on e sensory evaluation score

对回归方程求导，得到极大值为88.52，对应的发酵温度为41.18℃，蔗糖添加量为5.17%，接种量为2.90%，复配比例为（球∶杆）为0.96∶1，为方便实验，将发酵温度定为41.2℃，蔗糖添加量定为5.2%，接种量定为3%，复配比例定为1∶1。为检验响应面法所得结果的可靠性，采用上述发酵条件进行实验，感官评价评分为89.67±1.53。与理论预测值相比，其相对误差约为1.28%。说明该数学模型对酸奶发酵剂的发酵条件预测较为准确。

3 结论

通过单因素实验、Box-Behnken实验设计以及响应面分析法，建立响应值与各因素之间的数学模型，此模型对实验拟合很好。各因素影响感官评价评分的顺序为发酵温度＞蔗糖添加量＞接种量＞复配比例。根据回归模型，得出了酸奶发酵剂的最优发酵条件为：发酵温度41.2℃，蔗糖添加量为5.2%，接种量3%，复配比例1∶1。在此条件下发酵酸奶，其感官评价评分预测值为88.52，验证实验的酸奶感官评价评分为89.67±1.53。本实验为分离筛选出的菌株的实际应用奠定了基础，并为研发自主知识产权的酸奶提供了理论依据。

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