芡实发酵酒糊化糖化工艺的研究

李湘利，刘 静，张传敏，梁宝东，冯 磊，张春慧

（1.济宁学院生命科学与工程系，山东曲阜273155；2.大连民族学院生命科学学院，辽宁大连116600；3.天津科技大学食品工程与生物技术学院，天津300457）

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

芡实 山东鱼台鹤来香食品有限公司；大米 黑龙江方正宝兴新龙米业有限公司；麦芽 山东曲阜金丰麦芽有限公司；耐高温α-淀粉酶 北京东华强盛生物科技有限公司，活力20000U/g；糖化酶 湖南鸿鹰祥生物工程股份有限公司，活力50000U/g；安琪葡萄酒、果酒专用酵母 湖北安琪酵母股份有限公司；亚铁氰化钾、乙酸锌、酒石酸钾钠等 均为分析纯。

SZ-155浆渣分离磨浆机 广州旭众食品机械有限公司；JM-50胶体磨 杭州惠合机械设备有限公司；LB32T糖度计 广州市铭睿电子科技有限公司；酒精计 河北河间市黎民居仪表厂；PHS-3CW酸度计 上海般特仪器制造有限公司；FA-2004N分析天平 上海精密科学仪器有限公司；RL-100不锈钢板框过滤机 海宁郭店东亚过滤机械厂；果蔬汁（酒）生产线 江苏靖江食品机械有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 糊化实验 将料水比固定为1∶5，进行糊化实验，以糖化率为指标，确定糊化pH、时间。

1.2.2 糖化单因素实验 选取糖化酶添加量、pH、温度、时间、原料配比等条件，进行糖化单因素实验，以糖化率为指标，确定糖化单因素条件。

1.2.3 糖化正交实验 结合糖化单因素实验结果，选取糖化温度、糖化时间、pH、糖化酶添加量为实验因子，以糖化率为指标，进行正交实验，优化糖化工艺条件。

1.3 工艺流程与操作要点

1.3.1 工艺流程

佰草集和相宜本草等这些本土品牌的成功，从品牌层面上来看，是将“本草”这一中国特色国粹融入品牌价值中，改变了其品牌属性和基因。中国的传统文化中，发掘和运用中草药（汉方）进行美容、洗发护发已有数千年历史，这是跨国品牌难以企及的，也是跨国品牌的短板和软肋。因此，这场植物与化学科技的对决，中国本草文化与外国文化的对决，能避开本土品牌的短板，发挥其长板效应。

1.3.2 操作要点

1.3.2.1 原料的粉碎 取圆整、色白、无异味的芡实，用自来水清洗后磨碎。选取品质优良的浅色麦芽，用麦芽粉碎机进行回潮粉碎，以麦芽皮壳破而不碎为度。为提高浸出物收率，大米粉碎细度以通过80目筛为宜[13]。

1.3.2.2 糊化单因素实验中糊化液的制备 先按1∶1∶1的比例将破碎后的芡实、大米、麦芽混合配料，控制总料水比1∶5加水制浆，调整浆液pH，并记录初始体积，在90℃下保温5min后，再添加9U/g的耐高温α-淀粉酶继续保温。保温结束后煮沸灭酶5min，加水至初始体积，过滤得糊化液。

1.3.2.3 糖化单因素实验中糖化液的制备 按照1.3.2.2的方法配料制浆，调整pH6.0，于90℃下保温5min，按9U/g添加耐高温α-淀粉酶继续保温40min后煮沸灭酶5min。待糊化醪温度降至40℃时，调整醪液pH，在一定温度下保温5min，然后加入150U/g的糖化酶糖化保温，煮沸灭酶5min，加水至初始体积，经过滤得到糖化液。

为进一步探索糖化酶添加量和原料配比对糖化的影响，本实验调整糊化醪pH6.0，将浆液在55℃下保温30min；升温至90℃，按9U/g添加耐高温α-淀粉酶继续保温40min后煮沸灭酶5min，待糊化醪降温至40℃，调整醪液pH5.0，在55℃下保温5min，称取一定量的糖化酶和麦芽同时加入醪液继续保温，保温结束后煮沸灭酶5min，加水至初始体积，经过滤得到糖化液。

1.3.2.4 糖化正交实验中糖化液的制备 原料按2∶1∶2的比例配料，并将麦芽分成两等份，一份在配料时添加，另一份和糖化酶一同加入。调整糊化醪pH6.0，在55℃下保温30min；升温至90℃，按9U/g添加耐高温α-淀粉酶继续保温40min后降温至40℃，调整pH，在一定温度下保温5min，称取一定量的糖化酶和剩余的麦芽同时加入醪液继续保温，保温结束后煮沸灭酶5min，加水至初始体积，经过滤得到糖化液。

注：实验用耐高温α-淀粉酶和糖化酶的添加量均按总原料量计算添加。

1.3.2.5 糖化率的测定及糖化终点的确定 分别测定醪液糖化前的总糖含量和糖化结束时的还原糖含量，参照GB/T 15038-2006葡萄酒、果酒通用分析方法[14]，以糖化率评价糖化效果[12]，计算公式为：

测糖时，取50mL待测醪液，加2mL乙酸锌和亚铁氰化钾后定容至100mL，以干燥滤纸过滤，收集滤液备用。实验后期，用于酿酒的醪液则需保温至糖化终点，以碘试醪液不变蓝作为糖化终点。

1.3.2.6 芡实酒发酵中试 在所得最适糊化糖化条件下，进行芡实酒发酵中试实验[15]。调节发酵初始pH4.0，接种0.6%（v/v）复水活化后的安琪葡萄酒、果酒专用酵母，在28℃下主发酵8d，原酒经澄清、调配、杀菌等工序可得芡实酒。

2 结果与分析

2.1 糊化单因素实验

2.1.1 糊化pH对糊化效果的影响 分别在pH5.5、6.0、6.5、7.0的条件下糊化40min的实验结果见图1。

图1 不同糊化pH对糊化的影响Fig.1 Influence of different pH on pastification

由图1可知，在pH6.0糊化，醪液糖化率明显高于其他pH处理，这可能是pH影响了酶活性部位上有关基团的解离和酶活性部位的构象，进而影响了酶与底物的结合能力和催化能力[16]。

2.1.2 糊化时间对糊化效果的影响 在pH6.0，分别糊化30、40、50、60min的实验结果见图2。

由图2可知，随糊化时间的延长，糖化率呈先升高后降低的变化趋势，尤以糊化40min时糖化率最高，这是因为糊化时间低于40min时，醪液中的淀粉不断吸水膨胀，直链淀粉不断溶出、降解；而糊化时间高于40min时，醪液中的酶不断钝化，低分子糖不断生成焦糖等聚合物，致使糖化率有所下降[8]，故本实验选择糊化时间为40min。

图2 不同糊化时间对糊化的影响Fig.2 Influence of different time on pastification

2.2 糖化单因素实验

2.2.1 糖化pH对糖化效果的影响 控制糖化温度55℃，糖化酶添加量150U/g，分别调整pH3.0、4.0、5.0、6.0，糖化60min的实验结果见图3。

图3 不同糖化pH对糖化的影响Fig.3 Influence of different pH on saccharification

由图3可知，在pH3.0～4.0时，醪液糖化率随pH的升高而显著增加；当pH＞4.0时，糖化率反而开始下降，这可能与糖化酶的最佳酶解pH条件有关[17]。

2.2.2 糖化温度对糖化效果的影响 分别控制糖化温度40、50、60、70℃，并添加150U/g的糖化酶，于pH5.0下糖化60min的实验结果见图4。

图4 不同糖化温度对糖化的影响Fig.4 Influence of different temperature on saccharification

由图4可知，温度低于60℃时，糖化率随温度的升高显著增加；温度超过60℃后，糖化率迅速降低。这是因为温度的升高增加了单位时间内酶分子与底物的有效碰撞次数，影响了底物的结构，而温度过高则改变了糖化酶的催化活性，致使酶解作用减弱[10]。

2.2.3 糖化时间对糖化效果的影响 控制糖化温度55℃，pH5.0，糖化酶添加量150U/g，分别糖化50、60、70、80min的实验结果见图5。

图5 不同糖化时间对糖化的影响Fig.5 Influence of different time on saccharification

由图5可知，随糖化时间的延长，醪液糖化率不断增加，但当糖化时间超过70min时，糖化率不再增加，这是因在一定条件下，底物与糖化酶作用时间越长所生成的产物越多[10]，随着反应的进行，底物不断被利用，产物不断积累而产生抑制作用，产物不再增加，此时糖化率最高，故糖化时间宜控制在70min左右。

2.2.4 原料配比对糖化效果的影响 大米淀粉颗粒小（2～10μm），结构紧密，糊化困难[18]。为进一步探索原料配比对糖化效果的影响，调整大米添加量为原料总量的20%。分别按芡实∶大米∶麦芽=3∶1∶1、2∶1∶2、1∶1∶3配料，与原料配比1∶1∶1进行比较。采用分次添加麦芽的方法，外加糖化酶150U/g，糖化60min的实验结果见图6。

图6 不同原料配比对糖化的影响Fig.6 Influence of different materials ratio on saccharification

由图6可知，原料配比对糖化率有明显影响，以芡实∶大米∶麦芽＝2∶1∶2时糖化率最高，可达77.48%；按1∶1∶3的配比所得糖化率较低，且麦芽味较重；而3∶1∶1的原料配比的芡实用量大，成本较高。

2.2.5 糖化酶添加量对糖化效果的影响 按芡实∶大米∶麦芽＝2∶1∶2，分别添加糖化酶100、150、200、250、300、350U/g，糖化60min的实验结果见图7。

图7 不同加酶量对糖化的影响Fig.7 Influence of different glucoamylase amount on saccharification

由图7可知，当糖化酶添加量在150～300U/g时，糖化率随加酶量的增加而显著提高，但添加量超过300U/g时，由于还原糖的积累对酶解反应产生抑制作用，致使糖化率不再增加，故糖化酶用量宜控制在300U/g左右。

2.3 糖化正交实验

在糖化单因素实验基础上，选取温度、时间、pH、糖化酶添加量为实验因子，进行L9（34）正交实验，各实验因素水平与实验结果见表1，方差分析见表2。

表1 糖化正交实验直观分析Table 1 The orthogonal experiment of saccharification direct analysis

表2 糖化正交实验方差分析Table 2 The variance analysis of orthogonal experiment of saccharification

由表1可知，各因素对糖化效果影响的主次关系依次为D＞A＞C＞B，即加酶量＞温度＞pH＞时间；糖化条件的最佳组合为A3B3C1D2，即温度65℃，时间75min，pH3.5，加酶量300U/g。

由表2可知，pH、温度、加酶量对糖化率的影响差异极显著，而糖化时间对糖化率的影响在所选水平范围内不显著。本着经济节约的原则，时间采用65min（B1），调整糖化组合为A3B1C1D2，即温度65℃，时间65min，pH3.5，加酶量300U/g。在此条件下，进行验证实验和发酵中试的结果表明，糖化率可达87.15%，还原糖含量为13.08%。将还原糖含量调整至210g/L，发酵所得芡实酒酒精度为12.0%。

3 结论

通过实验得到芡实酒糊化糖化的最佳工艺为：原料配比即芡实、大米、麦芽按2∶1∶2的比例混合，按料水比1∶5糊化；糊化前添加麦芽总量的50%的麦芽，调整醪液pH6.0，在55℃下保温30min；继续升温至90℃进行糊化，同时添加耐高温α-淀粉酶9U/g，调节醪液pH6.0，保温40min后降温至65℃，调整pH3.5，并添加剩余的麦芽和糖化酶300U/g，糖化65min。此工艺条件下，醪液糖化率为87.15%，制得的糖化液还原糖含量可达13.08%。发酵前调整醪液还原糖含量210g/L，经酒精发酵可得酒精度为12.0%的芡实发酵酒。

[1]张汆，魏兆军，袁怀波，等.芡实淀粉的酶解特性及体外消化模拟分析[J].食品科学，2012，33（3）：23-27.

[2]张汆，李敏，薛连海，等.三种吸附剂对芡实多酚的吸附特性研究[J].食品工业科技，2010，31（10）：101-104.

[3]夏红，曹卫华.芡实的营养价值及保鲜加工[J].中国食物与营养，2004（10）：27-28.

[4]王晶，张然，王立梅，等.芡实淀粉理化性质的研究[J].食品与生物技术学报，2011，30（4）：561-564.

[5]赵翾，李红良，叶倩雯.芡实多糖的粗提取及其对羟自由基的清除效果[J].食品与发酵工业，2010，37（11）：177-182.

[6]SAMARJIT DAS，PETER Der Utpal，Raychaudhuri，et al.Das：the effect of Euryale ferox（makhana），an herb of aquatic origin，on myocardial ischemic reperfusion injury[J].Molecular and Cellular Biochemistry，2006，289：55-63.

[7]刘静，张爱民，刘开伟，等.芡实采后加工与功能性的最新研究进展[J].食品工业，2011（10）：89-91.

[8]秦捷，姚茂君.凉薯液化糖化工艺[J].食品研究与开发，2010，31（10）：117-121.

[9]郝国东，徐磊，段志林.提高玉米淀粉糖化率新工艺[J].黑龙江农业科学，2009（4）：102-103.

[10]李兴革，李志江，牛广财，等.利用糖化酶水解马铃薯淀粉生产糖浆的工艺研究[J].中国酿造，2010，35（6）：59-62.

[11]张国权，史一一，罗勤贵，等.荞麦淀粉双酶水解工艺条件的优化研究[J].中国粮油学报，2008，23（4）：86-91.

[12]刘月英，田金强，张子德.板栗酒糖化工艺的研究[J].食品科技，2007，32（8）：211-213.

[13]肖连冬，臧晋，吴德海，等.双边发酵法生产发芽糙米酒的研究[J].食品工业科技，2007，28（7）：153-155.

[14]GB/T 15038-2006.葡萄酒果酒通用分析方法[S].北京：中国标准出版社，2006.

[15]李湘利，刘静，张春慧，等.芡实酒发酵条件的优化[J].食品与发酵工业，2012，38（9）：84-89.

[16]王镜岩，朱圣庚，徐长法.生物化学（上册）[M].北京：高等教育出版社，2002：379-380.

[17]张爱民，周天华.食品科学与工程专业实验实习指导用书[M].北京：北京师范大学出版社，2011：101-104.

[18]顾国贤.酿造酒工艺学[M].北京：中国轻工业出版社，1996：17，42.