鸡爪脱皮蛋白质提取工艺的研究

聂新艳，曹 栋，耿亚男，杨贝贝

（食品科学与技术国家重点实验室，江南大学食品学院，江苏无锡214122）

鸡爪脱皮是在鸡加工中，经热水烫而退下的鸡爪的表皮。预计世界肉鸡产量于2012年达到8300万t，并以3.2%的年生产增长量继续增加，我国鸡肉产量将达到1300万t[1-2]，由此每年世界上得到鸡爪脱皮约达到10万t左右。这些鸡爪脱皮除少量用于制革和饲料外[3]，大量的鸡爪脱皮目前没有得到深度开发与利用，废弃后污染环境。由于对鸡爪脱皮的研究一直没有得到相关领域科学家的重视，相关研究非常少，因此目前对鸡爪脱皮的认识非常有限。通过实验，对鸡爪脱皮的成分、氨基酸组成以及体外消化率进行分析得知，鸡爪脱皮中含有68%的粗蛋白，氨基酸组成比例也表明，鸡爪脱皮蛋白是一种优质蛋白，但体外消化实验表明，其体外消化率为42%，说明鸡爪脱皮蛋白是一种利用率很低的蛋白。本文以鸡爪脱皮为原料，采用碱提蛋白法，结合单因素实验以及响应面分析，研究了碱法制备蛋白质各种因素对鸡爪脱皮蛋白质提取率的影响以及相互作用，确定碱法提取鸡爪脱皮蛋白质的最优条件。该结果的报道为开发利用鸡爪脱皮提供了依据。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

鸡爪脱皮 昆山食品公司；氢氧化钠、盐酸、硫酸铜、硫酸钾、浓硫酸、硼酸、溴甲酚绿、甲基红 均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司；无水碳酸钠 基准纯，国药集团化学试剂有限公司。

超级恒温水浴 上海浦东荣丰科学仪器有限公司；HJ-1磁力搅拌器 江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司；DELTA 3020 pH计 梅特勒-托利多仪器上海有限公司；低速台式大容量离心机 无锡市瑞江分析仪器有限公司；HYP-1004消化炉 上海纤检仪器有限公司；凯氏定氮装置、电炉 无锡市华达电热器材厂；DSHZ-300水浴恒温振荡器 江苏省太仓市实验设备厂。

1.2 实验方法

1.2.1 原料的处理 鸡爪脱皮经过挑拣去除石块、鸡毛等杂质，风干，粉碎机粉碎，过30目筛，得到鸡爪脱皮粉。将鸡爪脱皮置于正己烷浸泡3h脱脂，之后室温下3500r/min，离心10min去除溶剂。重复4次，基本去除鸡爪脱皮粉中的油脂。取残渣在室温下使正己烷自然挥发，然后将鸡爪脱皮粉于干燥箱中60℃烘干，再过30目筛，脱脂鸡爪脱皮粉用聚乙烯袋密封后放置于干燥器中保藏待用。

1.2.2 鸡爪脱皮蛋白质提取 精确称取一定量的鸡爪脱皮脱脂原料，加入氢氧化钠溶液，在一定的温度下水浴加热并不断搅拌，经过一定的提取时间后，3500r/min离心15min，取上清液，凯氏定氮法测定上清液蛋白质含量。所有的实验进行三次平行。鸡爪脱皮脱脂原料中蛋白质测定同样采用凯氏定氮法。

1.2.3 鸡爪脱皮蛋白质提取率的测定 计算公式如下所示：

鸡爪脱皮蛋白质提取率（%）=提取液的蛋白质含量/原料中蛋白质含量×100。

1.2.4 单因素实验 采用碱提法提取蛋白质过程中，影响提取率的主要因素：提取时间、提取温度、液料比、碱液浓度。用一定量的脱脂原料，提取时间（4、5、6、7、8h），提取温度（室温、26、40、50、60、70、80℃），液料比（20∶1、25∶1、30∶1、35∶1、40∶1、45∶1（mL/g）），碱液浓度（0.3%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%），以蛋白质的提取率为衡量标准，来确定单因素鸡爪脱皮蛋白质的提取条件。

1.2.5 优化实验[4-7]根据Box-Benhnken实验设计原理，同时结合单因素实验，设计4因素3水平的响应面分析实验，以各个单因素为自变量，以鸡爪脱皮蛋白质提取率为响应值，获得最佳的因素水平组合。响应面实验设计因素水平表见表1。

表1 响应面实验设计因素及水平Table 1 Factors and levels of response surface experimental design

2 结果与讨论

2.1 单因素实验结果

采用碱提法提取蛋白质，以蛋白质的提取率为衡量标准，来确定鸡爪脱皮蛋白质提取的各个单因素条件。

图1 碱液浓度对蛋白提取率的影响Fig.1 Effect of alkali concentration on protein extraction rate

2.1.1 碱液浓度对蛋白质提取率的影响 碱液浓度会影响蛋白质的溶解程度，进而改变蛋白质的提取率，在提取时间为6h，液料比为35∶1（mL/g），温度为50℃的条件下，考察碱液浓度对鸡爪脱皮蛋白质提取率的影响，结果如图1所示。

从图1中可以看出，随着碱液浓度的提高，提取率先增加然后降低，碱液浓度为1.5%时提取率最高。碱液浓度太低，蛋白质不能很好的溶解到碱液里，而随着碱液浓度的增加蛋白质水解成小分子多肽或者氨基酸的趋势加剧，使得提取率显著上升，但碱浓度过大又容易导致部分蛋白质发生脱氨、脱羧、肽键断裂等变性反应，降低溶解度。因此，碱液浓度选为1.5%。

2.1.2 提取时间对蛋白质提取率的影响 在碱液浓度为1.5%，液料比为35∶1（mL/g），温度为50℃的条件下，考察提取时间对蛋白提取率的影响，结果如图2所示。

图2 提取时间对蛋白提取率的影响Fig.2 Effect of extraction time on protein extraction rate

由图2可见，蛋白质提取率随着提取时间的延长而增加，影响最为明显的是前6h，在4～6h，提取率接近于直线增加，当提取时间在6h以后，增加趋于平缓，同时考虑到能源的节约和避免因时间过长导致微生物生长的影响，初步选择提取时间为6h。

2.1.3 液料比对蛋白质提取率的影响 液料比也会影响蛋白质的提取率，在提取时间为6h，碱液浓度为1.5%，温度为50℃的条件下考察液料比对蛋白质提取率的影响，结果如图3所示。

图3 液料比对蛋白提取率的影响Fig.3 Effect of liquid-material ratio on protein extraction rate

由图3可以看出，液料比从20∶1到40∶1之间，提取率随液料比的增大而不断提高，溶剂体积越大意味着溶剂中蛋白质浓度越低，使固相和溶剂相中的蛋白质出现浓度差，这是提取中质量扩散的动力之一[8]。当液料比大于40∶1时蛋白质提取率趋于平缓。所以液料比选为40∶1。

2.1.4 提取温度对蛋白质提取率的影响 在一定范围内，提取温度的升高有助于蛋白质溶解度的增加，从而提高蛋白质得率。在提取时间为6h，液料比为40∶1（mL/g），碱液浓度为1.5%的条件下，考察提取温度对蛋白质提取率的影响，结果如图4所示。

由图4可以看出，随着温度的增加，蛋白提取率不断提高，一般来说，温度越高越有利于蛋白质的提取，温度为室温（21℃）到60℃之间影响最明显，这区间蛋白提取率从39%上升到74%。温度大于60℃后提取率增加缓慢，考虑到蛋白质的性质以及经济因素初步选定提取温度为60℃。

图4 提取温度对蛋白提取率的影响Fig.4 Effect of extraction temperature on protein extraction rate

表2 响应面实验设计与结果Table 2 Design and results of response surface experiment

2.2 响应面优化实验结果分析

2.2.1 响应面实验设计与结果 影响蛋白质提取率的4个重要因素并非孤立的发生作用，它们之间存在相互关联，根据Box-Behnken中心组合设计原理，以提取温度、提取时间、碱液浓度和液料比4个因素为自变量，设计了4因素3水平的响应面分析实验，响应面实验设计及结果见表2。

2.2.2 响应面模型拟合及方差分析 通过多元回归和逆向消除获得二次多项回归模型，二次响应曲面模型拟合于方程：

回归模型的显著性检验和方差分析见表3。

表3 回归模型的方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

由表3可知，该模型的F值为23.39且模型p＜0.0001，表明模型极显著。X1、X2、X12、X22、X32、X42对模型的影响都是显著的（p＜0.05），失拟项不显著（p=0.0905＞0.05），表明回归线方程与实际情况吻合较好，实验误差较小。模型的调整确定系数为91.80%，说明该模型能解释91.80%的相应值的变化；信躁比为15.669，远大于4，说明模型显著；变异系数（CV）为1.42%，则表明实验具有较好的重复性，可信度较高。图5反映了蛋白质提取率实测值与预测值之间的相关性，回归决定系数（R2）为95.99%，由此可知，该模型具有良好的线性分布，其残差（实测值与预测值之间的差异）为正态分布[4]，综合上述分析结果，充分显示出该模型对实验拟合情况很好，可以对提取温度、提取时间、液料比和碱液浓度这四个因素进行分析和预测。

图5 蛋白质提取率实测值与预测值之间的相关性图Fig.5 Plot showing correlation of the actual and predicted values of protein extraction rate

由回归方程系数可知，X1和X2为正显著；二次项X12，X22，X32和X42为负显著。影响鸡爪脱皮中蛋白质的提取率的四个因素影响顺序为：X1提取温度＞X2提取时间＞X4碱液浓度＞X3液料比。

2.2.3 响应曲面分析 通过响应曲面分析可以得到，实验的不同因素对鸡爪脱皮蛋白质提取率的影响，以及这些因素相互作用对蛋白质提取率的影响。根据多元回归方程所做的的响应曲面图见图6。该组图直接反映出两因素交互作用对响应值的影响效应，并从中确定最佳因素水平范围。

图6 两因素交互作用对鸡爪脱皮蛋白质提取率影响的响应面图Fig.6 Response surface plots demonstrating the pair wise interactive effects of four extraction conditions on CFP protein extraction rate

响应曲面坡度与蛋白质提取实验的各个影响因素有很大的关系，坡度越大，即坡面越陡峭，则响应值受响应因素的影响也越大，反之则说明响应值受该因素的影响越小。等高线为椭圆状表明两影响因素的交互作用明显，如果为圆形则表明交互作用不明显。由图6可以看出，碱液浓度和液料比、提取时间和碱液浓度、提取时间和液料比的交互作用明显，其他交互项交互作用不明显，其中提取温度对响应值的影响最大，呈二次方效应，而液料比对蛋白质提取率的响应值影响最小。

2.3 最优条件的确定及验证

使用Design-Expert软件对响应面模型进行二次多项拟合，得到响应值（鸡爪脱皮蛋白质提取率）对四个影响因素因子（提取温度、提取时间、料液比和碱液浓度）的二次多项回归方程，由回归方程分析得最优条件组合为：提取温度为63.08℃，提取时间为6.29h，料液比为40.79∶1，碱液浓度为1.47%，鸡爪脱皮中蛋白质提取率预测值为82.1601%，考虑到实际操作的便利，将提取工艺修正为提取温度为63℃，提取时间为6.3h，液料比为41∶1（mL/g），碱液浓度为1.5%，并在此条件下进行三次平行实验验证，其结果为81.7821%，响应面回归模型能较好的预测各影响因素与鸡爪脱皮中蛋白质提取率之间的关系。

3 结论

为了更好的利用鸡爪脱皮，本文采用碱法提取鸡爪脱皮中的蛋白质。以鸡爪脱皮蛋白质提取率为衡量标准，进行单因素实验和响应面优化实验，得到最佳提取工艺条件为：提取温度为63℃，提取时间为6.3h，液料比为41∶1（mL/g），碱液浓度为1.5%，影响鸡爪脱皮蛋白质的提取率的四个因素影响顺序为：X1提取温度＞X2提取时间＞X4碱液浓度＞X3液料比，经验证实验表明鸡爪脱皮蛋白质提取率为81.7821%。

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