多层海藻酸-壳聚糖聚电解质膜微球的制备与体外释放特性研究

南艳微，郑晓玲（浙江大学医学院附属妇产科医院，杭州 310006）

海藻酸钠是存在于褐藻的天然高分子，壳聚糖是从贝壳类、昆虫、细菌细胞壁及蘑菇提取的甲壳质（几丁质）去乙酰化后得到的产物，自然界储量丰富，因其价格低廉，且具有优良的生物相容性、生物降解性和资源可持续性等优点，越来越受到研究者的青睐[1-2]。海藻酸钠是荷负电的天然多糖，壳聚糖是荷正电的天然多糖，海藻酸钠分子链上大量的羧基与壳聚糖分子链上大量的伯氨基通过聚电解质络合反应形成具有一定机械强度、弹性和通透性能的聚电解质复合水凝胶膜，并作为药物控释载体[3-4]、酶固定化载体[5]等广泛应用于生物医药领域。

以海藻酸钠、壳聚糖为囊材制备的单层聚电解质膜微球已有大量文献[6-7]报道，但多层聚电解质膜微球少有报道。为此，本文以牛血清白蛋白（BSA）为模型药物，以海藻酸钠、壳聚糖为囊材，采用乳化-交联法包裹海藻酸钠微球制备BSA-海藻酸-壳聚糖微球（BSA-ACM）、BSA-海藻酸-壳聚糖-海藻酸钠微球（BSA-ACAM）、BSA-海藻酸-壳聚糖-海藻酸-壳聚糖-海藻酸钠微球（BSA-ACACAM），并对其包封率、载药量及其体外释放特性进行研究。

1 材料

FJ-200高速分散均质机（上海标本模型厂）；高速离心机（德国Heraeus公司）、LGJO 5-Ⅱ型冷冻干燥机（军事医学科学院实验仪器厂）；ELx 800酶标仪（美国Bio-Tek Instruments.INC公司）。

海藻酸钠[南京化学试剂有限公司，批号:10111021160，黏度:≥0.02 Pa·s（1%溶液，25℃）]；壳聚糖（玉环海洋生化有限公司，批号:D03012202，分子质量:80000，去乙酰度:85%）；牛血清白蛋白（BSA，华美生物工程公司，批号:0108）；BCA试剂盒（江苏碧云天生物技术研究所）；吐温、司盘、异辛烷、异丙醇等化学试剂均为分析纯。

2 方法

2.1 BSA-ACM的制备

精密称取BSA，溶于1%海藻酸钠溶液20 ml作为水相，以5%司盘-异辛烷40 ml为油相，两相高速乳匀3 min后，滴加适量第二乳化剂30%吐温80，再乳匀3 min，逐滴加入8%氯化钙溶液适量后乳匀3 min，加入异丙醇后在相同转速下最后乳匀3 min。离心后收集微球，用1%的壳聚糖溶液代替水溶液加入离心后所得微球中，孵育30 min，离心收集微球后再用同样的壳聚糖溶液清洗1次，用水清洗2次后冷冻干燥，即得。

2.2 BSA-ACAM的制备

在乳化制得BSA-ACM后，用0.25%海藻酸钠溶液代替水溶液加入离心后所得的微球中，孵育30 min，离心收集微球后用水清洗2次，冷冻干燥，即得。

2.3 BSA-ACACAM的制备

离心后收集的BSA-ACAM，用1%的壳聚糖孵育30 min，离心收集，再用0.25%海藻酸钠溶液孵育30 min，离心收集微球后用水清洗2次，冷冻干燥，即得。

2.4 形态学观察

用显微镜和扫描电镜观察BSA-ACM、BSA-ACAM、BSA-ACACAM的形态及表面特征。

2.5 包封率和载药量的测定

将一定量的微球分散于磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4）中，在37℃、200 r/min下恒温振荡9 h，离心，移取上清液后补充介质，反复提取3次后合并上清液，采用Micro-BCA法于570 nm波长处测定吸光度，以吸光度（A）为横坐标，BSA质量浓度（c）为纵坐标，进行线性回归，然后计算微球包封率和载药量[6]。包封率指微球中药物量占总投药量的百分比；载药量指一定量微球中所含药物的量占总质量的比值。

2.6 体外释放研究

分别精密称定约30 mg的BSA-ACM、BSA-ACAM、BSAACACAM至Eppendorf管中，各加入0.9%NaCl溶液释放介质3 ml，置37℃、70 r/min下振荡器内释放，按一定时间间隔2000 r/min 离心 10min，取上清液 0.5ml，补充 0.5ml新鲜介质[7]。Micro-BCA法测定BSA浓度，并按累积释放量（Q）公式计算:

式中Qi:第i次取样时Q；ci:第i次取样时接收液中的药物浓度；V:接收液体积；ci－1:第（i－1）次取样时接收液中的药物浓度；Vi:每次取样体积；Q0:药物释放总量。以Q为纵坐标，时间t为横坐标作图，得药物累积释放曲线，考察24和360 h内的体外释药情况，同时进行Higuchi方程拟合。

2.7 统计学处理

3 结果

3.1 微球形态及粒径

微球形态及大小分布见图1。

图1 3种微球的扫描电镜图a.BSA-ACM；b.BSA-ACAM；c.BSA-ACACAMFig 1 SEM photograph of 3kinds of microspheresa.BSA-ACM；b.BSA-ACAM；c.BSA-ACACAM

结果，BSA-ACM、BSA-ACAM、BSA-ACACAM均呈球形，表面光滑，不粘连，平均粒径分别约为（3.79±1.33）、（3.52±0.96）、（3.07±1.17）μm。

3.2 包封率和载药量的测定

3.2.1 Micro-BCA法。回归方程为c＝0.7147 A+0.0123（r＝0.9992，n＝3）。结果，BSA检测质量浓度在10～500 μg/ml之间呈现良好的线性关系。

3.2.2 包封率和载药量。BSA-ACM、BSA-ACAM、BSAACACAM包封率分别为（65.78±4.98）%、（63.99±4.83）%、（55.00±1.50）%，载药量分别为（17.97±1.33）%、（16.95±0.46）%、（16.47±1.49）%。

3.2.3 体外释放试验。体外释放行为均符合Higuchi方程，方程拟合结果见表1。图2和图3分别为BSA-ACM、BSA-ACAM、BSA-ACACAM在24 h和360 h内的体外释放曲线。

表1 BSA-ACM、BSA-ACAM、BSA-ACACAM体外释放方程拟合结果Tab 1 Results of equation fitting of BSA-ACM，BSA-ACAM，BSA-ACACAM release in vitro

结果可见，BSA-ACM、BSA-ACAM、BSA-ACACAM在24 h内Q分别为32.15%、25.59%、16.72%，无明显突释现象。微球的体外释放速率与聚电解质膜的层数呈负相关，BSAACACAM前24 h体外释放速率低，与BSA-ACM、BSA-ACAM有显著性差异（P＜0.05），BSA-ACM与BSA-ACAM的体外释放无显著性差异（P＞0.05）。在随后24～360 h内BSA从微球中的释放量呈缓慢增长趋势，表明3种载药微球缓释效果明显。

图2 3种微球24h的体外释放曲线Fig 2 24h release profiles of 3kinds of microspheres in vitro

图3 3种微球360h的体外释放曲线Fig 3 360h release profiles of 3kinds of microspheres in vitro

4 讨论

海藻酸钠是聚阴离子多糖，在水溶液中带负电荷；壳聚糖是聚阳离子多糖，在酸性溶液中带正电荷，两者发生静电聚合反应形成微囊膜。这两者都是亲水性材料，具有良好的生物相容性，在药物制剂方面的应用日益增加。有文献[8]报道，海藻酸-壳聚糖膜和海藻酸-壳聚糖-海藻酸膜对BSA向海藻酸钠（钙）微球中的扩散有明显的阻碍作用，前者通透性强于后者，说明包裹不同层次的海藻酸-壳聚糖聚电解质膜对药物的扩散有一定程度的影响，这一点在本试验中也得到了证实。微球的通透性由交联程度、膜厚、膜孔径和孔分布决定[9]。海藻酸-壳聚糖聚电解质膜主要由多糖链的交联构成，3类微球的包封率无显著性差异（P＞0.05）。但是BSA在ACACAM中前24 h内的释放速率要比在ACM、ACAM中低（P＜0.05﹚，提示BSA主要包裹在ACM中。文献[10]提示反复包裹ACM只是增加微球膜的紧密性，使得微球表面细孔部分关闭，导致多层膜渗透性下降，从而延缓药物的释放。

BSA-ACM、BSA-ACAM、BSA-ACACAM载药量分别为（17.97±1.33）%、（16.95±0.46）%、（16.47±1.49）%，表明随包覆层数的增加，载药量有所下降，可能是操作过程的反复进行，离心、水洗及转移损失了一定的药物，但三者数据比较无显著性差异（P＞0.05）。

试验中发现孵育中所需海藻酸钠的浓度十分重要。对0.15%、0.25%、1.0%海藻酸钠溶液进行比较后发现，0.15%海藻酸钠溶液强度不够，制备的ACACAM释放与ACAM、ACM无显著性差异（P＞0.05）；1.0%的海藻酸钠溶液黏度太大，ACM在其中分散性差，聚结成团状；0.25%为比较合适的浓度，ACM在其中分散性良好。

改变海藻酸钠和壳聚糖的组成和成膜条件可调节膜厚、膜孔径大小和膜孔分布，改变微球的通透性。本次试验只对单一海藻酸钠浓度、单一分子质量及浓度的壳聚糖浓度制备的微球进行了研究，对药物在多层海藻酸-壳聚糖聚电解质膜微球中特性有一定的提示作用，但仍有很多因素值得进一步考察研究。

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