维生素E对青鱼幼鱼生长、免疫及抗氨氮胁迫能力的影响

黄 云 胡 毅 文 华 钟 蕾 郇志利李金龙 毛小伟,4 肖调义

(1.湖南农业大学动物科学技术学院, 长沙 410128; 2.中国水产科学研究院长江水产研究所, 淡水生态与健康养殖重点开放实验室, 武汉 430223; 3.中国水产科学研究院淡水渔业研究中心, 无锡 214081;4.益阳益华水产品有限公司, 益阳 413000)

在高密度集约化养殖中, 水产养殖动物残饵和排泄物氨化作用产生大量氨态氮, 是诱发鱼病的主要环境因子。大多数硬骨鱼类对氨氮毒性非常敏感[1,2]。水体中过高的氨氮浓度能干扰生物体抗氧化系统,使部分抗氧化物质含量和酶活性下降[3,4], 机体清除自由基的能力降低, 脂质过氧化产物增多, 导致机体非特异性免疫防御系统遭到破坏[5], 外源病菌的易感性增加[6—8]; 鳃、肾、肝等组织结构病变, 呼吸和排泄系统受损[9—11]。近年来, 通过营养学调控理论, 提高水产动物免疫机能, 缓解外界环境应激越来越受到关注。维生素E(VE)是Evans在19世纪20年代发现的具有α-生育酚生物活性的一类脂溶性维生素, 其第六位碳原子上羟基极易被氧化, 具有很强的还原性, 是生物体内最重要的脂溶性抗氧化剂和免疫增强剂[12]。相关研究表明, 维生素E参与水产动物的细胞免疫和体液免疫[13,14], 可提高细胞介导的免疫反应、抗体滴度和吞噬细胞指数, 促进T淋巴细胞的有丝分裂[15]; 还可有效增强水产动物抵抗亚硝酸盐[16]、酸应激[17]和拥挤胁迫能力[18]。青鱼(Mylopharyngodon piceus)是我国传统淡水养殖鱼类的四大家鱼之一, 在人工养殖过程中面临水体环境突变(以氨氮突变为主)和疾病滋生等问题。本研究通过饲料中VE的添加, 探讨VE对青鱼生长、免疫和抗氨氮胁迫能力的影响, 以期为 VE的营养调控青鱼抵抗外界环境应激提供科学指导。

1 材料与方法

1.1 实验动物与驯化

实验青鱼为购自湖南水产科学研究所的同一批鱼苗。实验前暂养于室外水泥池(5.0 m×1.0 m×1.5 m)中驯化2周, 日饱食投喂商品饲料2次(8：00, 16：00),日换水量占总体积1/3。暂养期间, 水温 (24±3), ℃pH 7.31±0.2, 溶解氧含量5.0 mg/L以上, 并用次溴酸盐氧化法进行水体氨氮监测, 总氨氮值小于或等于0.2 mg/L, 正式试验前停食24h。

1.2 实验设计

参照商品饲料配方, 配制粗蛋白 36.0%和粗脂肪6.0%的基础饲料(总能约18.0 kJ/g, 表1), 以VE醋酸酯(干粉状, 含量 50%, 青岛玛斯特生物技术有限公司友情提供)作为 VE添加源, 在基础饲料中分别添加 VE 0(对照组)、12.5、25、50、100 和 200 mg/kg,共配制6组实验饲料。饲料原料经粉碎后过40目筛,微量成分采取逐级扩大法混合均匀, 采用双螺旋压条机挤压出1.5 mm粒径饲料颗粒, 于阴凉处风干后−20℃保存备用。各处理组饲料实测值分别为：14.36、25.14、37.66、62.97、113.92和 210.45 mg/kg。

挑选健康活泼、规格一致的实验青鱼于室内水族箱中投喂基础饲料驯化, 1周后挑选规格均匀的青鱼[初始质量(7.27±0.40) g]随机分配到 18个水族箱中, 每箱放养 30尾, 每组3个重复, 日投饵量为体质量的 3%—5%, 分 2次投喂(8：00—9：00, 16：00—17：00), 分别占总量的40%和60%。日换水1次, 换水量占总体积1/3并清除箱内粪便。日充气12h, 溶氧不低于5.0 mg/L。实验期间平均水温 (28±2), ℃pH 7.31±0.2, 养殖水总氨氮浓度低于 0.2 mg/L, 自然光周期, 养殖持续8周。养殖实验结束后, 青鱼饥饿 24h, 从每个水族箱中捞取青鱼置于盛有少量水的桶中, 计数、称重, 记录生长情况。根据生长情况,选择有代表性的3组, 未添加VE组、生长最好组和高水平VE添加组, 即对照组、62.97和210.45 mg/kg VE组, 每箱随机捞取10尾试验青鱼, 进行24h氨氮胁迫试验, 氨氮胁迫实验参照胡毅等[19]方法, 为了减少捕捞应激对实验结果的影响, 在进行麻醉前将捞取的青鱼放于盛有 20 L水的水箱中静置 60min,然后滴入丁香油溶液短暂麻醉, 进行样品的采集工作。需进行氨氮胁迫实验的处理组青鱼, 在计数、称重、记录生长情况后, 随机捞取10尾青鱼放于盛有10 L水的水箱中静置60min后, 缓慢倒入配置好的40 mg/L氨氮溶液10 L, 使水体氨氮浓度达到20 mg/L左右, 每个水族箱的氨氮胁迫起始时间控制间隔在15min左右, 以便于24h后样品采集时胁迫时间一致。胁迫后为避免捞取应激, 直接滴入丁香油至水族箱中进行短暂麻醉取样。期间连续充气, 保证溶氧不低于5.0 mg/L。

表1 基础饲料组成及营养水平Tab.1 Formulation and chemical composition of the basal diet

1.3 样品采集、分析与计算

生长指标 实验起始和结束时, 分别对各水族箱中青鱼进行记数、称重。

特定生长率(SGR)= [(LnWf− LnWi)/T]×100%

Wf、Wi和T分别表示平均终体重(g)、平均初体重(g)和饲养时间(d)。

饲料和组织维生素E含量 在氨氮胁迫前后,分别从每个水族箱随机取 3尾试验青鱼, 冰盘上解剖并分离出肝脏和轴上肌, 称取一定量肝脏或肌肉,捣碎、匀浆、离心, 制备上清液备用。肝脏、肌肉和血清中VE含量均参照南京建成VE含量测定试剂盒比色法测定。饲料中 VE含量利用高效液相层析色谱(HPLC)测定。

血清指标 在氨氮胁迫前后, 从各试验水族箱中随机捞取8尾试验青鱼, 放入盛有0.15 mL/L丁香油溶液中短暂麻醉, 用 1 mL无菌注射器尾静脉采血, 置于无菌离心管中, 4℃静置12h, 3500 r/min离心15min, 取上层血清移入离心管中放置−80℃超低温冰箱中保存备用。

皮质醇(COR)采用上海继锦化学科技有限公司鱼ELISA试剂盒测定, 丙二醛(MDA)、总超氧化物歧化酶(T-SOD)和过氧化氢酶(CAT)活性采用南京建成生物科技研究所试剂盒测定。

鳃丝Na+/K+-ATP酶活力 在氨氮胁迫前后,冰浴条件下, 取试验青鱼两侧第 2鳃弓上的鳃丝,用生理盐水润洗, 滤纸吸干水分, 用于鳃丝 Na+/K+-ATP酶(NKA)活性测定。其测定参照胡毅等[19]的方法。NKA活性单位定义为： 以每小时每毫克组织蛋白中ATP酶分解ATP产生1 μmol无机磷的量为1个 ATP 酶活力单位 [μmol P/(mg·h)]。

1.4 统计分析

实验结果以平均值±标准差表示, 用 SPSS17.0软件进行单因素方差分析, 当差异显著时(P<0.05),则采用Duncan进行多重比较; 用t检验检测氨氮胁迫前后的变化。

2 结果

2.1 维生素E对青鱼幼鱼生长的影响

随着饲料中VE含量的增加, 青鱼幼鱼SGR呈升高趋势, 当 VE含量达到或超过 37.66 mg/kg时,其SGR均显著高于对照组(P<0.05), 且37.66、62.97、113.92和 210.45 mg/kg VE组组间无显著差异(图1A)。经折线模型回归分析表明, 青鱼幼鱼获得最高SGR时饲料中VE有效含量为45.0 mg/kg (图1B)。

图1 维生素E对青鱼幼鱼生长的影响(平均数±标准差, 重复数=3)Fig.1 Effects of dietary vitamin E levels on growth of juvenile Mylopharyngodon piceus (mean ± SD, n=3)

2.2 氨氮胁迫对青鱼幼鱼组织中维生素 E含量的影响

肌肉、肝脏和血清中VE含量均随着饲料中VE含量的升高而呈显著上升趋势(P<0.05), 且当饲料中VE含量达到或超过113.92 mg/kg时, 肌肉和肝脏中VE含量均达到饱和状态(图2)。

氨氮胁迫使青鱼肌肉和肝脏中VE有下降趋势,各处理组肌肉中 VE含量胁迫前后差异不显著, 而肝脏中 VE含量在氨氮胁迫前后均差异显著(P<0.05), 胁迫后, 210.45 mg/kg VE组肝脏VE含量仍显著高于其他组(P<0.05)。氨氮胁迫前后对照组青鱼血清VE含量无显著变化, 但62.97和210.45 mg/kg VE组血清VE含量有升高趋势, 仅210.45 mg/kg VE组血清VE含量胁迫前后差异显著, 且胁迫后62.97和210.45 mg/kg VE组血清VE含量仍显著高于对照组(P<0.05)。

图2 维生素E对氨氮胁迫前后组织维生素E含量的影响Fig.2 Effects of dietary vitamin E on tissue vitamin E contents of juvenile Mylopharyngodon piceus befor and after ammonia-nitrite stress

2.3 氨氮胁迫对部分血清生化指标的影响

饲料VE对血清COR无显著影响(图3), 随着饲料 VE含量的升高, 血清 MDA含量呈下降趋势且210.45 mg/kg VE组MDA含量显著低于对照组(P<0.05)。血清T-SOD和CAT活性随着饲料VE含量升高呈上升趋势, 当VE含量超过37.66 mg/kg时, CAT活性显著高于对照组, 而VE含量达到210.45 mg/kg时, T-SOD活性才显著高于对照组(P<0.05)。

氨氮胁迫使血清T-SOD和CAT活性降低, COR和MDA含量升高, 其中氨氮胁迫使对照组COR和MDA含量显著升高(P<0.05)。但饲料中VE能有效降低胁迫后血清COR和MDA升高幅度, 62.97和210.45 mg/kg VE添加组氨氮胁迫前后COR含量差异不显著, 且胁迫后210.45 mg/kg VE组COR含量显著低于对照组(P<0.05); 62.97和210.45 mg/kg VE组氨氮胁迫前后 MDA含量虽显著升高, 但氨氮胁迫后, 210.45 mg/kg VE组MDA含量仍显著低于对照组(P<0.05)。氨氮胁迫对各处理组血清CAT活性无显著影响, 却显著降低了对照组 T-SOD活性(P<0.05), 但62.97和210.45 mg/kg VE组T-SOD活性氨氮胁迫前后差异不显著, 且氨氮胁迫后, T-SOD活性仍显著高于对照组(P<0.05)。

2.4 氨氮胁迫对鳃丝NKA活性的影响

饲料中 VE对青鱼鳃丝 NKA活性无显著影响(图4)。在氨氮胁迫后, 对照组和62.97 mg/kg VE组NKA活性均有所下降, 而210.45 mg/kg VE组NKA活性有所上升, 仅对照组鳃丝 NKA活性胁迫前后差异显著(P<0.05), 且胁迫后210.45 mg/kg VE组均显著高于对照组(P<0.05)。

3 讨论

饲料中 VE含量在一定范围内可明显改善鱼类的生长性能, 缺乏或过量均会对生长产生负面效应[20—22]。本研究得到类似结果。通过折线模型分析得出, 青鱼获得最大特定生长率时VE有效含量为45.0 mg/kg, 与许氏平(Sebasres schlegeli)(VE有效需求量45 mg/kg)[21]的VE有效需求量相似。但低于大西洋鲑(Salmo salar)(VE有效需求量60 mg/kg)[23]、花鲈(Lateolabrax japonicus)(VE有效需求量 60.5 mg/kg)[24]、斑点叉尾(Ictalurus punctatus Rafinesque)(VE有效需求量100 IU/kg)[20]、鲤(Cyprinus carpio)(VE有效需求量 119 mg/kg)[22], 高于杂交条纹鲈(Morone saxatilis)(VE有效需求量28 mg/kg)[25]。不同鱼类对VE的代谢率不同, 可能导致对VE需求存在差异, 此外, 还与饲料的组成、实验鱼规格、投喂次数及水平、实验条件等多种因素有关。

图3 维生素E对氨氮胁迫前后青鱼幼鱼血清生化指标的影响Fig.3 Effects of dietary vitamin E on serum biochemical indexs of juvenile Mylopharyngodon piceus before and after ammonia-nitrite stress

图4 维生素E对氨氮胁迫前后青鱼幼鱼鳃丝NKA活性的影响Fig.4 Effect of dietary vitamin E on gill NKA activities of juvenile Mylopharyngodon piceus before and after ammonia-nitrite stress

组织中 VE含量与饵料中 VE的含量呈正相关性[24], 但随摄入VE量的增加, 组织中VE的积累量将到达饱和[21,24]。在本实验中也存在同样的趋势,随着饲料中 VE含量的升高, 肌肉、肝脏和血清中VE含量呈显著升高趋势, 当 VE含量超过 113.92 mg/kg时, 肌肉和肝脏中VE含量变化趋于饱和。氨氮胁迫对肌肉 VE含量无显著影响, 但使各组肝脏中 VE含量显著降低, 且胁迫后 62.97和 210.45 mg/kg VE组血清VE含量均有不同程度的升高。有学者[25]认为, 肝脏内可能存在一个维生素E的“库”,在调节外界环境应激上存在相关性。当鱼体受到应激后, 肝脏中储存的维生素E可能被释放至血液中,缓解机体因应激所受氧化胁迫而导致抗氧化物质含量的下降。而氨氮胁迫使血液中VE含量升高, 可能跟胁迫后机体动用肝脏中储存的VE有关。然而, 中华鳖(Pelodiscus sinensis)[17]的研究发现, 在酸应激后, 中华鳖肝脏中VE并无显著变化, 其原因可能与应激的类型、强度和应激时间的长短等因素有关。

动物体内参与清除体内过多自由基的防御系统包括非酶系统和酶系统。非酶系统主要包括 VE、VC、谷胱甘肽及微量元素等; 酶系统主要包括SOD(清除超氧阴离子)、CAT(清除过氧化氢)等。VE作为细胞内抗氧化剂, 可稳定多不饱和脂肪酸及脂肪合成与分解的中间产物不被氧化破坏, 还可影响花生四烯酸的代谢和前列腺素的功能[26]。在甲壳类动物如中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis Milne-Edwards)[26]、凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)[27], 鱼类如大菱鲆(Scophthalmus maximus)[28]、黄颡鱼(Pelteobagrus fulvidraco)[29]等研究表明, VE可显著提高机体抗氧化能力, 降低脂质过氧化产物 MDA产生[29,30]。本实验得到相似结果, 随着饲料中 VE含量的增加, 青鱼血清T-SOD和CAT活性呈升高趋势, 血清 MDA含量呈下降趋势。在中华鳖[17]和建鲤(Cyprinus carpiovarJian)[18]的研究中, VE还能有效提高机体抵抗环境应激的能力, 但暂无关于 VE增强水产动物抗氨氮胁迫的相关报道。本研究结果显示, 氨氮胁迫虽对各处理组血清CAT活性无显著影响, 但显著降低了对照组血清 T-SOD活性, 而饲料中VE能有效缓解氨氮胁迫对血清T-SOD活性的影响。氨氮胁迫还显著增加了各处理组青鱼血清MDA含量, 但62.97和210.45 mg/kg VE组胁迫后MDA含量仍低于对照组。这表明, 饲料中VE可增强机体抗氧化能力, 缓解因氧化胁迫导致丙二醛的产生, 从而能有效增强机体抗氨氮胁迫能力。

下丘脑−垂体−肾间组织轴是鱼类应激调节中枢,能释放促肾上腺皮质激素, 促进头肾细胞皮质醇激素的合成与释放, 而皮质醇激素通常不被储存, 直接进入血液。因此, COR常作为衡量鱼体应激强度的指标[13]。在鱼类受到外界环境刺激后, 血液中COR明显升高[19]。有研究结果表明, 动物血液中COR与VE水平呈负相关[31]。但在本研究中, 各处理组血清中皮质醇含量无显著差异, 这与中华鳖[17]的研究结果相似。氨氮胁迫显著增加了对照组青鱼血清COR含量, 而饲料中VE可有效缓解氨氮胁迫造成的血清COR升高, 胁迫后210.45 mg/kg VE组COR显著低于对照组。这说明 VE对应激后 COR的升高有明显抑制作用, 与 VE调节中华鳖[17]、金鲷(Sparus aurata)[31]等受环境胁迫后COR的研究结果相似。

鳃是鱼类呼吸、氨氮排泄及渗透调节的主要部分, NKA是鳃组织泌氯细胞及细胞器的膜上存在的一种蛋白酶, 在鱼体渗透调节过程中起着非常重要的作用。氨氮胁迫对青鱼鳃丝NKA活性可产生显著影响, 氨氮胁迫6h后, 青鱼鳃渗透调节被有效激活,鳃丝NKA活性在6—48h呈上升趋势[19]。目前, 有关VE对水产动物鳃丝NKA活性的影响无相关报道,但何敏[32]指出, VE可显著提高斑点叉尾肝胰脏和肠道 NKA 活性, 此外, 在人[33]和大鼠[34]的研究中发现, VE可提高应激下红细胞NKA活性。本研究显示, VE对青鱼鳃丝NKA活性虽无显著影响, 但氨氮胁迫使对照组 NKA显著降低, 而 62.97和210.45 mg/kg VE组 NKA却无显著差异且 210.45 mg/kg VE组胁迫后均显著高于对照组。这说明VE在调节氨氮胁迫后鳃丝NKA活性起到一定促进作用。

综上所述, VE可促进青鱼生长, 其获取最大生长的有效VE需求为45.0 mg/kg。VE可提高机体血清抗氧化酶活性, 抑制MDA产生, 增加机体抗氧化能力, 还可缓解胁迫对机体的应激强度、对抗氧化系统和渗透调节酶活性的影响, 从而提高机体抗环境胁迫能力。

致谢：

衷心感谢刘巧林、马晓、金红春、周伟、刘敏、姚一斌、王晓娜、高巍、金柏涛、何志刚等在实验样品采集过程中提供热心的帮助！

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