星形胶质细胞瘤组织中NGF和TrkA表达及临床意义

尹 宏，永 胜，赵海龙，黄 欣

(青海大学医学院病理教研室，西宁810001)

胶质瘤是颅内最常见的肿瘤，具有发病率高、复发率高、病死率高和治愈率低的特点，由于其呈侵袭性生长，术后极易复发，且复发的胶质瘤有恶性转化的特征，使得胶质瘤一直是神经外科治疗的重点和难点。星形胶质细胞瘤是最常见的胶质瘤，占胶质瘤的78%以上，根据肿瘤细胞的分化程度和增殖潜能等可分成4个不同的等级［1］，通常认为Ⅰ～Ⅱ级属于低度恶性，Ⅲ～Ⅳ级则属于高度恶性。2010年1月～2012年6月，我们检测了神经生长因子(NGF)及其受体酪氨酸蛋白激酶A(TrkA)在人脑星形胶质细胞瘤组织中的表达，旨在进一步探讨两者在人脑星形胶质细胞瘤发生、发展中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料 选取青海大学附属医院神经外科手术切除的脑星形胶质细胞瘤组织标本48份(胶质瘤组)，按WHO病理分级法Ⅰ级、Ⅱ级、Ⅲ级、Ⅳ级各12份。患者男28例，女20例;年龄30～70岁;≤50岁30例，＞50岁18例。所有患者均经病理证实诊断，且术前均未接受化疗、放疗或其他针对肿瘤的治疗。取瘤旁正常脑组织48份(正常组)作对照。两组一般资料无统计学差异。主要试剂:兔抗NGF和TrkA多克隆抗体(一抗)(美国CHEMICON);SP试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司);逆转录—聚合酶链反应试剂盒(TaKaRa公司);DNA2000(上海生工公司);琼脂糖(大连宝生物公司);引物采用Primer Premier5.0软件设计，由大连宝生物公司合成。

1.2 NGF和TrkA蛋白表达检测 采用免疫组化SP法。标本常规包埋、切片，DAB棕色呈色，阴性对照用PBS代替一抗，其余均照说明书操作。NGF和TrkA蛋白阳性判断标准:高倍镜下随机选择10个视野，每个视野至少记数100个细胞，按每一切片阳性细胞比例及染色强度计分，采用半定量积分法。胶质瘤组NGF蛋白阳性着色定位于细胞质和细胞核，正常组NGF蛋白阳性着色主要定位于细胞质，两组TrkA蛋白阳性着色定位于细胞膜和细胞质，以出现棕黄色颗粒者为阳性细胞。阳性细胞＜5%为0分，5% ～25%为1分，26% ～50%为2分，51% ～75%为3分，＞75%为4分。染色强度:无着色或与背景均匀一致的淡黄色为0分，浅棕黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。两项计分乘积为0～1分判为阴性，2～4分为+，5～7分为++，＞7分为+++;+～+++为阳性。

1.3 NGF和TrkA mRNA检测 采用RT-PCR法。取出冻存的新鲜标本(两组均为100 mg)，Trizol法提取组织总RNA，测定总RNA浓度及纯度。以下均严格按照说明书操作。PCR产物于15 g/L的琼脂糖凝胶做电泳，以无菌水代替cDNA模板的PCR管为阴性对照，天能凝胶成像系统对电泳条带拍照并进行半定量分析。NGF及TrkA mRNA相对表达量以同一反应体系中目的产物电泳条带密度指数与内参对照β-actin电泳条带密度指数的比值表示。

1.4 统计学方法 采用SPSS13.0统计软件，计量资料以¯x±s表示，采用t检验;计数资料行χ2检验。RT-PCR结果与免疫组化结果的相关性采用Spearman等级相关分析。α=0.05。

2 结果

2.1 NGF和TrkA蛋白表达 胶质瘤组及正常组NGF蛋白表达阳性率分别为77%、31%，TrkA蛋白表达阳性率分别为85%、43%，两组比较P均 ＜0.05。

2.2 NGF和TrkA mRNA表达 胶质瘤组及正常组NGF mRNA的相对表达量分别为0.78±0.19、0.41 ±0.12，TrkA mRNA 的相对表达量分别为0.83±0.04、0.51 ±0.13，两组比较，P 均 ＜0.05。

2.3 NGF和TrkA表达与星形胶质瘤临床病理参数的关系 见表1。

表1 NGF和TrkA表达与星形胶质瘤临床病理参数的关系

2.4 NGF与TrkA表达的相关性 胶质瘤组NGF、TrkA蛋白和NGF、TrkA mRNA表达均呈正相关(r=0.805，P ＜0.01)。

3 讨论

NGF是神经营养素(NTs)家族中的一员，由神经系统的星状细胞、少突神经胶质细胞合成，通过旁分泌途径调控神经元分化、生存、凋亡及突触调制，调节神经细胞生长、分化、存活和成熟的糖蛋白［2］。TrkA属于酪氨酸激酶受体家族中的一种跨膜糖蛋白，NGF的生物学效应主要由TrkA介导［3］。NGF与高亲和力受体TrkA结合使TrkA空间结构改变，受体胞内段的酪氨酸激酶结构域被激活，发生受体自身磷酸化，通过PI3K-Akt，Ras-MAPK和PLcY通路介导发挥神经营养活性。有文献报道，神经胶质细胞恶变产生的肿瘤细胞(如星形胶质瘤、胶质母细胞瘤以及神经母细胞瘤细胞等)也可以分泌NGF［4］;胶质瘤组织高表达 NGF 及 TrkA［5］。亦有报道，TrkA表达可以促进胶质瘤细胞增殖［6］。NGF可促进胶质母细胞瘤细胞株的有丝分裂，这一作用可以被TrkA磷酸化抑制剂K252a剂量依赖性的抑制，说明NGF对胶质母细胞瘤细胞株的促增殖作用是通过激活TrkA的磷酸化起作用的［7］。但有报道在儿童星形胶质细胞瘤的研究中NGF及TrkA呈低表达［8］。Hansen等［9］的研究认为 NGF 可以诱导转TrkA基因的G55胶质瘤细胞发生不依赖Caspase激活的自体吞噬死亡过程，说明NGF可以通过多种途径对胶质瘤产生抑制作用。以上关于NGF及TrkA在胶质瘤中的表达及对胶质瘤细胞生物学作用的报道存在显著差异，可能与所选取研究对象NGF及TrkA的基础表达水平及分布模式有关。

本研究胶质瘤组NGF和TrkA蛋白、TrkA mRNA表达均明显高于正常组，提示NGF和TrkA可能参与了星形胶质细胞瘤的发生。本研究还发现，NGF和TrkA蛋白、TrkA mRNA表达与星形胶质细胞瘤病理分级相关，且随恶性程度增高而增加，提示NGF和TrkA在星形胶质细胞瘤细胞内表达水平与星形胶质细胞瘤病理级别有密切关系，NGF和TrkA高表达在星形胶质细胞瘤的发生发展过程中可能起促进作用。

总之，NGF和TrkA的表达可反映星形胶质细胞瘤的生物学行为，可作为判断星形胶质细胞瘤恶性程度和预后的有价值的指标。

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