啤酒麦芽真菌种类与酵母提前絮凝关系的研究

马晓晴，董建军，林 艳

(1.中国海洋大学食品科学学院，山东青岛266061;2.青岛啤酒股份有限公司，山东青岛266061;3.啤酒生物发酵工程国家重点实验室(筹)，山东青岛266061)

啤酒麦芽是啤酒发酵的关键原料，有原料选择不好会导致酵母超前絮凝(Premature Yeast Flocculation，简称PYF)现象产生。酵母超前絮凝现象是指当营养物质尚且充足时酵母就发生凝集沉降的现象。这种絮凝现象不仅对啤酒的发酵有一定影响，还可造成发酵中糖降解缓慢，利用率低，发酵不彻底，甚至导致啤酒不够澄清，酒精含量低，口感差等问题［1］。Nierop［2］的研究也发现PYF 能够引起发酵原料的使用不充分，导致浪费现象，增大工厂费用。引起酵母超前絮凝现象的原因有很多，多项研究表明引发这一现象的原因主要是微生物侵染大麦时，使大麦皮壳发生降解，产生一些高分子量的多糖，随之进入到发酵液中引发酵母絮凝［2-7］。杨春霞［8］等发现在制麦过程中麦芽受到一定量的霉菌污染时会引发PYF 现象。Nierop［2］也发现制麦过程中真菌的侵染可以使酵母过早絮凝。Axcell 等人［8］也提出了真菌分泌的酶可以作用大麦皮壳产生一些多糖，这些多糖组成了一部分PYF 因子，诱发酵母的超前絮凝。虽然不少学者都提出了真菌能够影响酵母絮凝，但尚不明哪些真菌能够明显引起酵母超前絮凝。因此，本课题采用筛选自PYF 阳性麦芽中的霉菌，并反侵染大麦，观察酵母提前絮凝，这是研究霉菌与酵母提前絮凝现象关系的最直接的方式，对相关方向的研究具有实际意义。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

啤酒麦芽 青岛啤酒股份有限公司，为PYF 阴性麦芽和阳性麦芽，阴性麦芽即PYF 标准麦芽(PYF值为100%)，不发生酵母提前絮凝现象，阳性麦芽为有PYF 现象的麦芽;啤酒酵母 青岛啤酒股份有限公司第五公司;马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)按照表1 配置1000mL 培养基，然后在121℃条件下灭菌20min;孟加拉红培养基按照表2 配制1000mL 培养基，115℃灭菌30min。

EBCF 粉碎仪 Buhler;LB-8 糖化仪 Lochner;Z1 Particle Counter Beckman Coulter。

表1 PDA 培养基成分表Table 1 The component of PDA medium

表2 孟加拉红培养基成分表Table 2 The component of Rose Bengal medium

1.2 实验方法

1.2.1 啤酒麦芽真菌的分离鉴定

1.2.1.1 啤酒麦芽上微生物的分离纯化 采用涂布法，接种于孟加拉红平板培养基上，并设置3 个平行组。倒置于32℃恒温培养箱，培养48～72h。然后挑取带有个体特征差异的单菌落并分别接种于PDA 平板培养基上，在32℃恒温倒置培养，待菌落长出后，检查其个体形态特点是否一致，重复此步骤至纯化后转移至PDA 培养基斜面上，32℃恒温培养长出，4℃条件下保存。

1.2.1.2 生理生化特征和显微形态观察 用显微镜对染色后的菌体进行形态结构观察，甲基蓝［9-10］作染色液，记录形态特点。

1.2.1.3 啤酒麦芽中微生物的分子生物学鉴定 由中国海洋大学食品科学与工程学院微生物实验室完成鉴定。

1.2.2 酵母絮凝实验 该实验是采用PYF 值测定的方法来判断酵母的絮凝性，通过对PYF 阴性麦芽皮壳进行微生物处理，与无处理的麦芽对比分析，测定发酵液中悬浮的酵母数以及残糖浓度。

1.2.2.1 麦皮预处理 称取一定量的标准麦芽用EBCF 粉粹机完全粉碎，然后用孔径0.9mm 的20 目筛子将皮壳与麦粉分离。取2.5g 皮壳加入到250mL锥形瓶中，并倒入200mL 蒸馏水，分别接种一定量的真菌，100r/min 摇床培养20h。

1.2.2.2 麦汁制备 采用协定麦汁的方法，用LB-8糖化设备制备协定麦汁，双层滤纸过滤。

1.2.2.3 麦汁前酵分析 实验中麦汁是由PYF 阴性麦芽和实验麦芽制得的，为了确保絮凝现象发生的差异不是由麦汁本身营养物质差异引起的，协定麦汁后用糖度计测定糖度，补加葡萄糖，确保麦汁糖浓度是在同一水平。

1.2.2.4 酵母准备 无菌操作取生产使用的酵母泥(2～4 代，由青岛啤酒第五有限公司提供)，取回后放置冰箱内，在8h 内使用。取一支用酒精棉擦拭的40mL 离心管，移入酵母泥，于4000r/min 离心10min，倾去上清液;另取一支用酒精棉擦拭的40mL离心管，称取离心后的酵母泥1.95g，再加入22.5mL无菌蒸馏水，加盖置于涡旋振荡器上震荡至充分混匀。

1.2.2.5 接种发酵 接种前，在装有灭菌麦汁的SCOTT 瓶中加入一滴消泡剂，然后吸取充分混匀的酵母悬液2.5mL，加入麦汁中，充氧，静置2～3min，轻轻摇动后将麦汁倒入干燥、洁净的50mL 比色管中，使用锡箔纸将口封住;立即置于20℃恒温水浴中发酵40h。

2 结果与讨论

2.1 啤酒麦芽皮壳上真菌种类结果分析

经涂板分离纯化和筛分后得到8 种菌，如图1 所示，根据各菌种的形态可以看出2 号为黑曲霉，5 号为青霉，其余菌种不确定，对其做显微镜观察和分子生物学鉴定。由各菌种形态学特征和ITS 区序列分析可知，8 种菌均为霉菌，结果见表3。

图1 8 种霉菌在PDA 斜面培养基上形态Fig.1 The morphological characteristics of 8 kinds of fungi on PDA

2.2 PYF 值测定结果分析

从PYF 阳性麦芽上的菌种中分离筛选得到八种霉菌，分别为镰刀菌、黑曲霉、白地霉、黄曲霉、青霉、芽枝孢菌、米根霉和极细链格孢菌。为了确定致PYF 现象的关键菌种，进行酵母絮凝性实验，实验中分别用这八种菌处理麦芽皮壳，然后再制取麦汁，进行发酵实验，测定PYF 值，重复多次，结果如图2所示。

表3 啤酒麦芽上真菌鉴定结果Table 3 Result of fungi isolated from beer malt

当PYF 值为0～85 时，酵母提前絮凝现象明显，85～115 时酵母提前絮凝程度轻微，PYF 值在115 以上时酵母延迟絮凝。在多次实验中，米根霉及黄曲霉实验组PYF 值在0 ～85 范围内的比例均大于60%，有明显致PYF 现象，且米根霉实验组最为突出，PYF 值在0～85 范围内的比例高达90%，两种菌都是明显致PYF 现象菌种;镰刀菌实验组PYF 值在0～85 区间内所占比例接近50%，属于次明显致PYF现象的菌种;白地霉和极细链格孢实验组PYF 值在85～115 范围内的比例大于60%，属于致PYF 现象弱势菌种;黑曲霉和芽枝孢菌实验组PYF 值在85～115范围内的比例接近50%，但也有致PYF 现象的可能;而青霉实验组PYF 值在三个范围内的比例分布较均匀，无明显倾向，说明这种菌致PYF 现象不稳定，这可能与菌种的量和酶活性有关，需要进一步实验验证，确定量效关系。

图2 PYF 测定结果饼图Fig.2 The result of Premature Yeast Flocculation by pie chart

3 结论

啤酒麦芽受到污染后易引起PYF 现象，这与麦芽上的微生物相关，尤其是霉菌。从有PYF 现象的麦芽上分离出八种霉菌，分别为镰刀菌、黑曲霉、白地霉、黄曲霉、青霉、芽枝孢菌、米根霉和极细链格孢菌。其中米根霉和黄曲霉为明显致PYF 现象的菌种，镰刀菌为致PYF 次级明显菌种，极细链格孢菌和白地霉为致PYF 现象弱势菌种，芽枝孢菌和黑曲霉为轻微致PYF 现象菌株，而青霉致PYF 现象不稳定，这可能与菌种的量和酶活性有关，需要做进一步实验验证。

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