黑木耳多糖的提取分离及体外抗凝血作用研究

王辰龙，张子奇，王 曼，丁之恩，* ，闫晓明

(1.安徽农业大学茶与食品科技学院，安徽合肥230036;2.安徽省农业科学院农产品加工研究所，安徽合肥230031)

黑木耳又称云耳、黑菜，是一种质优的胶质食用菌和药用菌。我国黑木耳资源丰富，年产量5000t 左右，占世界总产量的90%以上，为开发应用黑木耳提供了有利条件。黑木耳多糖具有预防冠心病、高血压、高血脂、抗血栓、抗衰老、抗癌防癌、调节免疫等作用［1-3］。目前应用于临床治疗的抗凝血药物主要是肝素和香豆素类药物，有诱发血小板症等副作用。开发对血栓性疾病具有预防作用的新型药物或功能性食品具有重要的意义。因而，探索黑木耳多糖对人体血液系统的影响具有重要的意义［4］。目前报道具有抗凝血作用的多糖类物质有茶叶多糖［5］、桑叶多糖［6］、玉米芯水溶性多糖［7］等，并对不同来源的多糖进行纯化、分子量大小组分分离、多糖修饰等，均在一定条件下表现出了抗凝血活性。本实验以大别山野生黑木耳为原料，通过正交实验优化黑木耳多糖提取工艺，经纯化后研究其抗凝血作用的最适条件。已有文献报道的多糖类物质的抗凝血作用都是在实验室条件下的研究，本实验近似模拟生物体温度、血浆pH 条件，对黑木耳多糖的真实抗凝血效应进行研究，为充分利用黑木耳资源以及在生物、医药、食品方面的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

黑木耳 安徽省金寨县大别山生态农产品公司;纤维素酶(100000U/g)、果胶酶(20000U/g) 国药集团化学试剂有限公司;95%乙醇、浓硫酸、苯酚、葡萄糖、氢氧化钠、氯仿、正丁醇、浓氨水、双氧水、柠檬酸钠等 均为分析纯。

T6-新世纪紫外可见光分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司;SB5200D 超声波清洗仪 宁波新芝生物科技股份有限公司;电子天平 梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司;DK-S24电热恒温水浴锅 上海精宏实验设备有限公司;RE-52AA旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂;MPG-3型CAL200 凝聚仪 上海斯隆医电设备有限公司;DL-5-B 高速离心机 上海安亭科学仪器厂;DHG-9423A 型电热恒温鼓风干燥箱 金坛市荣华仪器制造有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 黑木耳多糖提取工艺流程 原料→干燥(60℃、24h)→粉碎→过筛(60 目)→提取→过滤→上清液→醇沉多糖→除蛋白、脱色→静置→离心→上清液→冷冻干燥→多糖粗品

1.2.2 葡萄糖标准曲线的绘制［8］准确称取干燥的葡萄糖0.01g，溶解后定容到100mL 容量瓶中，即为葡萄糖标准溶液。分别吸取0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6mL 的葡萄糖标准溶液于试管中，补水至2mL。分别加入质量分数6%的苯酚溶液1mL，再加入浓硫酸5mL，摇匀，室温下避光静置20min 后于490nm 下测定吸光度，相同条件下以2mL 水做空白，以多糖浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。

1.2.3 黑木耳多糖的提取方法 黑木耳多糖的提取分别采用热水提取法［9］、碱液提取法［10］、超声波提取法［11］、超声波协同复合酶提取法［12-17］。其中，超声波协同酶法的操作方法:黑木耳干粉按1∶50(w/v)加水，加入适当磷酸二氢钾-磷酸氢二纳缓冲溶液调节pH 到5.0，待温度升至45℃，以500U/g 加入果胶酶，在150W 超声波功率下酶解60min 后迅速升温至90℃钝化酶活10min;再加入适当磷酸二氢钾-磷酸氢二纳缓冲溶液调节pH 到7.5，调节温度到50℃，再以700U/g 加入纤维素酶，在100W 超声波功率下作用60min 后迅速升温至90℃钝化酶活10min，过滤得清液，离心取上清液，减压浓缩至原体积三分之一时，加入三倍体积的95%乙醇沉淀多糖，静置过夜，洗涤。将多糖沉淀复溶，反复脱蛋白、离心，最后冷冻干燥。

1.2.4 黑木耳多糖的纯化［18-19］

1.2.4.1 脱蛋白 采用Sevage 法［20］，按照黑木耳多糖水溶液1/4 体积加入氯仿/正丁醇(5∶1)试剂［12］，剧烈振荡30min，离心，倾出上清液，除去中间变性蛋白及下层氯仿，重复操作直至中间层无变性蛋白。再以4000r/min 离心10min，取上清液冷冻干燥。

1.2.4.2 脱色 采用H2O2法［21］，将多糖水溶液用氨水调pH 至8.0，40℃滴加5%H2O2，保温(40℃)3h，以透析分子量8000～14000 的DM36 透析袋于室温下透析4h，得黑木耳多糖。

1.2.4.3DEAE - 纤 维 素 柱 层 析［13，21］DEAE -Cellulose52(Cl-)经湿法装柱，用pH7.5 Tris-HCl 缓冲液平衡后，将脱蛋白、脱色后的多糖配成1%的溶液，上样5mL，经DEAE-纤维素柱层析，洗脱液为Tris-HCl +0.2mol/L NaCl，流速为0.5mL/min。用自动分部收集器收集洗脱液，每管收集5mL，将样品收集液稀释10 倍后用苯酚-硫酸法显色，在490nm 下测定吸光度，计算多糖含量。以试管数目为横坐标，吸光度为纵坐标绘制洗脱曲线图。收集主峰部分溶液，真空浓缩，用蒸馏水透析，收集透析袋内的多糖溶液，真空浓缩，冷冻干燥，备用。

1.2.5 黑木耳多糖抗凝血作用单因素实验［22］本实验选择PT(凝血酶原时间)为检测指标［23］，分别就多糖浓度、作用温度、pH 对动物血浆体外抗凝时间的影响进行研究。动物血浆的制备:选择雄性成年健康家兔，静脉取血，用0.13mol/L 柠檬酸钠抗凝(体积比3∶1)，3000r/min 离心10min，取上清血浆备用。

1.2.5.1 黑木耳多糖浓度对抗凝血作用的影响 将待测血浆分成5 组，每组0.50mL，分别加入2%、4%、6%、8%、10%的黑木耳多糖0.50mL，用磷酸盐缓冲液调节到pH7.4。对照组加入生理盐水0.50mL。35℃温育2min 后，加入兔脑促凝血酶原(按试剂说明书使用)，温育2min，再加入20mmol/L CaCl20.1mL混合均匀，用凝聚仪记录凝血酶原时间。

1.2.5.2 温度对黑木耳多糖抗凝血作用的影响 将待测血浆分成5 组，每组0.50mL，加入10%的黑木耳多糖溶液0.50mL，用磷酸盐缓冲液调节到pH7.4，对照组加入生理盐水0.50mL。35℃温育2min 后，加入兔脑促凝血酶原(按试剂说明书使用)，温育2min，再加入20mmol/L CaCl20.1mL 混合均匀，分别使待测样品保持在20、25、30、35、40℃，用凝聚仪记录凝血酶原时间。

1.2.5.3 pH 对黑木耳多糖抗凝血作用的影响 将待测血浆分成5 组，每组0.50mL，加入10%的黑木耳多糖溶液0.50mL，用磷酸盐缓冲液分别调节样品pH 到7.1、7.2、7.3、7.4、7.5，对照组加入生理盐水0.50mL。35℃温育2min 后，加入兔脑促凝血酶原(按试剂说明书使用)，温育2min，再加入20mmol/L CaCl20.1mL混合均匀，用凝聚仪记录凝血酶原时间。

1.2.6 黑木耳多糖抗凝血作用正交实验 在单因素实验的基础上，以凝血时间为考察指标，设计三因素三水平L9(33)的正交实验，确定多因素综合作用对黑木耳多糖抗凝血作用的影响。

表1 正交实验因素水平Table 1 Factors and levels of orthogonal design

1.2.7 黑木耳多糖的测定方法及得率计算［24-25］粗多糖含量测定:采用苯酚-硫酸法。根据式(1)～式(2)计算多糖含量及多糖得率。

1.3 数据分析

本实验数据统计采用SPSS17.0 分析软件对黑木耳多糖抗凝血作用进行ANOVA 单因素方差分析及Ducan’s 检验。

2 结果与分析

2.1 不同提取方法多糖提取率的比较

实验结果采用SPSS 处理，得到葡萄糖标准曲线方程为Y =45.193X-0.0134(R2=0.9984)。选取最佳单因素提取条件下，计算多糖的提取率，比较四种提取方法对黑木耳多糖提取效果的影响，结果见图1。

图1 不同提取方法多糖提取率的比较Fig.1 The comparison of different extraction methods on polysaccharide extraction efficiency

碱液提取法容易使部分多糖发生水解，破坏多糖的活性结构，降低多糖得率和不利于后续纯化。超声波法最大的优点是用时短、操作简单、效果明显，但功率过大可能会破坏多糖的活性结构，且长时间的超声波作用在提高多糖溶出率的同时也带出大量杂质，使其与多糖相混而不易分开。采用超声波复合酶提取法，其优点是用时短，条件温和，效果明显，但超声波场强的选择要兼顾酶的活性要求。多糖得率可达19.14%，在四种提取方法中最高。

2.2 黑木耳多糖的纯化

由图2 可知，在490nm 处测定洗脱液的吸光度绘制洗脱曲线，多糖粗提液经多次脱蛋白、脱色后没有出现蛋白质和核酸的特征吸收峰。可知经DEAE-纤维素柱层析分离后的多糖主要集中在8～16 管之间，即洗脱液36～80mL 之间，通过计算其纯度可达到83.23%。

2.3 黑木耳多糖体外抗凝血作用的单因素实验

2.3.1 黑木耳多糖浓度对抗凝血作用的影响 由表2 可以看出，35℃、pH7.4 的条件下，在实验范围内，检测体系中黑木耳多糖的浓度越高其抗凝血作用也越强，这与相关文献报道一致。当多糖浓度达到10%，凝血时间比对照组提高了2.5 倍左右。

2.3.2 温度对黑木耳多糖抗凝血作用的影响 由表3 可以看出，在10% 多糖浓度、pH7.4 的条件下，随着测定温度的升高，抗凝血作用随之加强。若温度继续升高，则失去了模拟生物体体温的意义，故选择35℃条件下的实验结果作为后续实验的参考。

图2 黑木耳多糖DEAE-52 纤维素柱层析洗脱曲线Fig.2 Chromatography of polysaccharides from Auricularia auricular on DEAE-52 cellulose

表2 不同浓度下黑木耳多糖的抗凝血作用Table 2 Anticlotting function of polysaccharides from Auricularia auricular on different concentration

表3 不同温度下黑木耳多糖的抗凝血作用Table 3 Anticlotting function of polysaccharides from Auricularia auricular on different temperature

2.3.3 pH 对黑木耳多糖抗凝血作用的影响 由表4可以看出，在35℃、10%多糖浓度下，pH 对黑木耳多糖血浆抗凝时间有着显著影响。结果表明，在pH7.4时，黑木耳多糖抗凝血效果最好。其原因可能是在pH7.4 时能保证家兔血浆正常的电离平衡和多糖活性所需的构象，这与国内外的相关报道一致。

表4 不同pH 下黑木耳多糖的抗凝血作用Table 4 Anticlotting function of polysaccharides from Auricularia auricular on different pH

2.4 黑木耳多糖抗凝血作用正交实验结果

综合以上单因素实验结果，以PT 为考察指标进行三因素三水平的正交实验，找出多因素综合作用下多糖对抗凝血作用的最佳因素组合，见表5。

表5 正交实验结果Table 5 The result of orthogonal test

由表5 正交实验结果极差分析可以看出，影响黑木耳多糖体外抗凝血作用的强弱因素依次为A ＞B ＞C，即黑木耳多糖浓度＞温度＞pH。由直观分析可知，最优条件组合为A3B3C2，即多糖浓度为10%、温度为35℃、pH 为7.4，在此条件下的凝血时间可以达到41.6s。在此条件下进行验证性实验，抗凝血时间可达到41.8s，这与直观分析得到最优条件组合相近。

3 结论

3.1 超声波协同复合酶法提取黑木耳多糖是目前应用较广、效果较好的提取方法:本实验采用在料液比1∶50(w/v)，调节pH 至5.0，按每克原料加入500U 的果胶酶，选择45℃、超声波功率150W 条件下酶解60min;升温灭酶后调节pH 至7.5，再按每克原料加入700U 的纤维素酶，选择50℃、超声波功率100W条件下酶解60min 的提取方法提取黑木耳多糖，提取率可达到19.14%。与传统方法相比，该方法缩短了提取时间，提高了多糖的提取率。

3.2 黑木耳多糖粗体物经脱蛋白、脱色和DEAE-纤维素柱层析后，通过真空冷冻干燥可使黑木耳多糖纯度达到83.23%。

3.3 黑木耳多糖体外抗凝血作用经单因素实验和正交实验可知在外界多因素综合影响下，黑木耳多糖体外抗凝血作用的最佳因素组合为:多糖浓度为10%、pH7.4、温度35℃，PT 值可达到41.8s。

［1］Zhang Hua，Wang Zhen yu.In vitro antioxidant activities of sulfated derivatives of polysaccharides extracted from Auricularia auricular［J］.International Journal of Molecular Sciences，2011，12(5):3288-3302.

［2］叶挺梅，钱令波，崔洁，等.黑木耳多糖对抗离体心脏缺血/再灌注损伤的研究［J］.中国应用生理学杂志，2010，26(2):154-158.

［3］Li Ling，Ding Jun-nan，Luo Li，et al.Preliminary studies on the early quality identification of Auricularia auricular［J］.Journal of Forestry Research，2005，16(1):61-64.

［4］陈和生，孙振亚.黑木耳多糖的研究进展［J］.时珍国医国药，2003，14(5):300-301.

［5］王淑如，王丁刚.茶叶多糖的抗凝血及抗血栓作用［J］.中草药，1992，23(5):254-256.

［6］包立军，张剑韵，黄龙全.桑叶中抗凝血活性成分的初步分离与纯化［J］.蚕业科学，2006，32(3):418-421.

［7］孙妹兰，万牲，刘月.玉米芯水溶性多糖的分离纯化和抗凝血活性研究［J］.分子科学学报，2006，22(2):131-133.

［8］郑静，常遁滔，林英，等.超声波法和超声波酶法提取灵芝多糖的条件和研究［J］.食用菌报，2006，13(1):48-52.

［9］樊黎生，张声华.黑木耳粗多糖的分离提取工艺及其理化性能研究［J］.食品科学，2004，25(8):100-103.

［10］欧阳天贤.碱溶性黑木耳多糖的分离、纯化和表征［J］.华中农业大学学报，1999，18(1):46-48.

［11］李钟玉，张京东，李临生.超声波法提取灵芝多糖的研究［J］.中国食用菌，2004，23(2):42-44.

［12］刘立梅.黑木耳多糖的分别酶解法提取及脱蛋白工艺研究［J］.中国酿造，2009(3):124-126.

［13］韩春然，唐娟，马永强.黑木耳多糖的酶法提取、纯化及性质研究［J］.食品科学，2007，28(2):53-55.

［14］娄在祥，张有林，王洪新.超声波协同酶法提取黑木耳多糖［J］.食品工业，2007(1):29-32.

［15］何泽超.纤维素的酶水解及超声波对其加速作用的研究［D］.成都:四川大学，2001.

［16］于淑娟，高大维，李国基.超声波酶法提取灵芝多糖的机理研究［J］.华南理工大学学报:自然科学版，2001(4):65-68.

［17］张立娟，于国萍，周国华.黑木耳多糖酶法提取条件的研究［J］.食品与开发，2005，26(3):89-91.

［18］樊黎生.黑木耳多糖AAP-IIa 级分的制备及其生物活性的研究［D］.武汉:华中农业大学，2006.

［19］赵鑫.黑木耳分级多糖抗氧化活性及其相关生理功能研究［D］.哈尔滨:东北林业大学，2011.

［20］齐慧玲，魏绍云，王继伦，等.Sevage 法去除白及多糖中蛋白的研究［J］.天津化工，2000(3):20-21.

［21］倪德江.乌龙茶多糖的形成特征、结构、降血糖作用及其机理［D］.武汉:华中农业大学，2003:57.

［22］梁进.茶叶多糖的化学修饰及体外抗凝血作用研究［D］.合肥:安徽农业大学，2008.

［23］王学峰，王鸿利.血栓与止血的检测及应用［M］.上海:世界图书出版公司，2002:164-184.

［24］王钦德，杨坚.食品实验设计与统计分析［M］.北京:中国农业大学出版社，2003:330-361.

［25］S.Suzanne Nielsen.食品分析［M］.北京:中国工业出版社，2002:118-121.