羰基还原酶工程菌构建及其应用于还原制备S-CHBE*

张志斌，吴小芳，杨慧林，，颜日明，曾庆桂，汪涯，朱笃，

1(江西师范大学 生命科学学院 江西省亚热带植物资源保护与利用重点实验室，江西 南昌，330022)2(江西科技师范大学 生命科学学院 江西省生物加工过程重点实验室，江西 南昌，330013)3(国家单糖化学合成工程技术研究中心，江西 南昌，330027)

S-4-氯-3-羟基丁 酸酯(S-4-chloro-3-hydroxybutanoate esters，S-CHBE)是合成Slagenins B 和C 以及他汀类药物—羟甲基戊二酰CoA(HMG-CoA)还原酶抑制剂等的关键手性中间体，具有重要的应用价值［1-2］。由于4-氯乙酰乙酸乙酯(ethyl 4-chloro-3-oxobutanoate，COBE)易于合成且价格低廉，因此SCHBE 往往以COBE 为底物通过化学或生物催化不对称合成制备。与化学催化不对称合成相比，利用羰基还原酶不对称合成S-CHBE 具有效率高、选择性强、成本低、装置简单、环境污染少等显著优势，受到了人们的广泛关注［3-5］。目前，采用筛选到的微生物开展全细胞催化合成单一构型的CHBE，存在微生物细胞中氧化还原酶类组成复杂、催化活性不高、产物CHBE 对映体过量值(e. e. )偏低等问题［1，4］;而采用还原酶在添加辅酶的情况下还原COBE 为单一构型的CHBE，存在辅酶价格昂贵、高纯度还原酶难以获得等难题［5］。因此，利用基因工程手段构建羰基还原酶基因工程菌，共表达葡萄糖脱氢酶等基因或偶联葡萄糖脱氢酶基因工程菌等提供还原力，可能成为实现高效、高选择性合成单一构型CHBE 的有效途径。

S1 羰基还原酶(S1-KRED)是从Candida magnoliae AKU4643 分离获得的，属短链醇脱氢酶家族，具有高催化活性和高立体选择性［6-7］。Yasohara 等从Candida magnoliae 中获得S1 羰基还原酶基因，用不同的宿主和载体构建羰基还原酶基因工程菌获得高比酶活羰基还原酶，偶联葡萄糖脱氢酶基因工程菌而实现不对称还原COBE 制备S-CHBE，对映体过量值(e. e. )接近100%［8］;叶齐等设计引物从Pichia stipitis 中获得羰基还原酶基因(PsCR 及PsCR II)，通过优化SD 序列而获得高酶活的重组工程菌，然后构建共表达载体来实现不对称还原COBE 制备S-CHBE，产物的摩尔转化率达91%，对映体过量值(e. e. )超过99%［9-10］。影响外源基因表达水平的因素很多，除了表达系统及旁侧的调控元件外，基因自身的编码序列中也含有与该基因表达水平有关的关键信息，密码子的选择就是影响表达的参数之一，但目前对该基因密码子进行系统优化、分析比较研究在国内未见正式报道。为进一步提高该酶在大肠杆菌中的表达效率，以实现S-CHBE 的高效制备，本研究利用JCat软件对S1 酮基还原酶基因序列进行E. coli 密码子偏嗜性优化，获得新的S1＇基因序列(Genbank accession No. KC426948)，并利用该序列构建重组菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-S1＇，在此基础上对其诱导表达条件进行优化，并对重组菌E. coli BL21(DE3)/pET28a-S1＇不对称还原COBE 制备S-CHBE 的能力进行了考察。

1 材料与方法

1.1 菌株和质粒

表达载体pET28a (+ )、宿主E. coli BL21(DE3)，均由作者实验室保存，葡萄糖脱氢酶(GDH)重组菌E. coli BL21(DE3)/pET28a -gdh 由本实验室构建，GDH 扩增自枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，采用Strecker HJ 的方法测定E. coli BL21(DE3)/pET28a-gdh 经诱导后的GDH 活力，酶活力为8.96 U/mg 蛋白［11］。

1.2 主要试剂和工具酶

限制性内切酶Nco I、Bam HI、T4-DNA 连接酶等，购自宝生物(大连)生物工程有限公司(TaKa-Ra);DNA 回收试剂盒(Gel Extraction Kit)、SDSPAGE 蛋白分子量标准，购自上海生物工程公司;异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)，购自索莱宝生物科技有限公司;4-氯乙酰乙酸乙酯(COBE)和S-4-氯-3-羟基丁酸乙酯(S-CHBE)，购自阿达玛斯(Adamas)有限公司;其余试剂和药品均为进口或国产分析纯。

1.3 羰基还原酶基因序列的人工合成

根 据 Yasohara［8］等 人 报 道 的 C. magnoliae AKU4643 的S1 羰基还原酶氨基酸序列，利用JCat 软件进行E. coli 密码子偏嗜性优化设计获得的基因序列S1＇(Genbank accession No. KC426948)，将S1 和S1＇基因序列均送到上海生工有限公司进行合成，N、C 端分别添加Nco I 酶切位点与Bam HI 酶切位点。

1.4 大肠杆菌表达质粒的构建

将上海生工公司全基因合成的S1 和S1＇ 基因通过Nco I/Bam HI 双酶切，克隆到表达载体pET28a(+)相应的酶切位点上，分别得到表达载体pET28a-S1 和pET28a-S1＇，然后转化到表达宿主E. coli BL21(DE3)中，分别得到基因工程菌BL21 (DE3)/pET28a-S1 和BL21(DE3)/pET28a-S1＇。质粒DNA的分离纯化、感受态细胞的制备等参照文献［12］及试剂盒说明进行。

1.5 KRED 酶活力的测定

(1)重组细胞粗酶液的制备。重组菌接种至含100 μg/mL 卡那霉素的LB 液体培养基，37 ℃、200 r/min 培养过夜后，以2%接种量接种至新鲜LB 培养基中(含100 μg/mL 卡那霉素)，37 ℃、200 r/min 培养至OD600nm为0.6 ～0.8 时，加入诱导剂IPTG(终浓度为1 mmol/L)，诱导6 h 后测定KRED 活力。取经诱导的菌液离心(4℃，4 000 r/min，10 min)，菌泥用0.1 mol/L 磷酸钾缓冲(pH6.5)重悬，超声破碎细胞(功率300 W，超声5 s，间歇5 s，共5 min)，离心(4 ℃，12 000 r/min，10 min)，上清液用于KRED 酶活测定。

(2)NADPH 标准曲线制作。配制不同浓度(0 ～1 mmol/L)的NADPH 标准溶液，分别在340 nm 处测定吸光值，建立NADPH 浓度(Y，mmol/L)与吸光度(X)间回归方程:Y = 0.478 7X - 0.004 2(R =0.997 7)。

(3)KRED 酶活测定。测定体系包括0.1 mol/L磷酸钾缓冲液(pH7.0)、0.1 mmol/L NADPH、5 mmol/L 的COBE 和适量粗酶液。加入酶液后立即开始扫描反应体系在340 nm 处吸光度的下降，根据标准曲线计算反应消耗NADPH 的量。酶活单位定义:每分钟消耗1 μmol NADPH 所需要的酶量［13］。同时，采用Bradford 方法测定该无细胞粗酶液中蛋白质含量，以牛血清白蛋白BSA 为标准品［14］。

1.6 目的蛋白SDS-PAGE 检测

采用5%的浓缩胶、15%的分离胶进行电泳，电泳后凝胶用考马斯亮蓝R250 染色，诱导后的空宿主菌株作阴性对照［14］。

1.7 工程菌转化活力的检测

分别取诱导后BL21(DE3)/pET28a-S1＇和E.coli BL21(DE3)/pET28a-gdh 细胞湿重各0.2 g，悬浮于10 mL 5%葡萄糖的磷酸缓冲溶液(0.1 mol/L，pH 7.0)，装入50 mL 具塞三角瓶中，25℃、150 r/min条件下振摇10 min，加入初始浓度为22.4 g/L 的底物COBE，继续振摇反应，转化过程中0.1 mol/L NaHCO3维持pH7.0。每隔1 h 定时取样，离心(4 000 r/min，10 min)沉淀菌体，取上清液反应液用等体积的乙酸乙酯萃取2 次，合并萃取液，减压蒸干溶剂得到样品，分析底物、产物含量及产物对映体过量值(e. e. )，实验重复3 次。

1.8 产物得率及光学纯度分析

COBE 和CHBE 浓度测定采用气相色谱法，分析条件为:岛津GC-2010，OV-1 色谱柱(30 m ×0.25 mm ×0.25 μm)，载气为氮气，进样量0.2 μL，气化温度250℃，检测器温度280 ℃，梯度升温(初始柱温80 ℃，保持3 min;以15℃/min 梯度升温至200 ℃，保持10 min);氢离子火焰检测器。COBE 和CHBE的出峰时间分别为6.9 min 和7.5 min。产物对映体过量值(e. e. )的测定采用HPLC 法，分析条件为:CHIRALCEL® OD-H 手性色谱柱(4.6 mm × 250 mm;Daicel Chemical Industries，Japan)，室温，流动相为V(正己烷)∶V(异丙醇)=95∶5，流速0.8 mL/min，λ=220 nm，S-CHBE、R-CHBE 保留时间分别为10.5 min、18.5 min。e. e. 的计算公式为:

其中R，S 分别为对映体的浓度。

2 结果

2.1 羟基还原酶基因密码子优化及表达载体的构建

根据C. magnoliae AKU4643 的S1 -KRED 氨基酸序列，利用软件JCat 进行E. coli 密码子偏嗜性优化设计后获得的S1＇基因序列。JCat 是一款专门用于密码子优化设计的软件，该软件综合考虑某物种最优密码子以及mRNA 二级结构等因素进行基因的密码子优化。在不改变氨基酸序列的情况下，我们选择了E. coli k12 菌株的最优密码子表进行优化，优化前和优化后的序列差异见图1。

图1 羟基还原酶基因密码子优化序列图Fig.1 Carbonyl reductase gene codon optimization sequence

根据1.4 的方法构建的羰基还原酶重组质粒pET28a-S1 和pET28a-S1＇(图2)，转入宿主细胞E.coli BL21(DE3)中，分别获得重组菌E. coli BL21(DE3)/pET28a-S1 和E. coli BL21(DE3)/pET28a-S1＇。阳性克隆中提取质粒分别用Nco I 和Bam HI 进行双酶切鉴定，产物为850 bp 左右一条带(图3)，这与插入的外源基因KRED 大小一致，表明外源基因已成功插入到载体pET28a(+)中。酶切阳性的质粒送上海生工公司测序，测序结果表明，KRED 基因开放读码框(ORF)长度为852bp，将该ORF 在Genebank nucleic-nucleic Blast 中进行检索，没有发现与S1’基因有很高同源性的序列，其与S1 基因序列同源性仅为68%。S1＇与S1 基因编码蛋白氨基酸序列相同，含283 个氨基酸，分子质量为30.4 kDa，均与C. magnoliae AKU4643 中报道的羟基还原酶S1 氨基酸序列一致。

图2 重组质粒示意图Fig.2 Recombinant plasmid

图3 重组表达质粒的酶切电泳分析Fig.3 Restrict enzyme digestion analysis of recombinant plasmid

2.2 KRED 基因的诱导表达

采用1.5 方法对重组菌进行诱导表达，经SDSPAGE 电泳分析表明，诱导后的重组菌在30 kDa 左右有明显的蛋白条带，与目的蛋白分子质量相符，而阴性对照菌在相应位置无蛋白条带(图4)。酶活力分析表明，BL21(DE3)/pET28a-S1＇的KRED 酶活达9.28 U/mg 蛋 白，为 BL21 (DE3)/pET28a-S1 的KRED 酶活(7.97 U/mg 蛋白)的1.16 倍。这表明，KRED 在E. coli BL21 中获得较好表达，且经E. coli密码子偏嗜性优化获得S1＇基因在E. coli 中表达效果更好。

图4 SDS-PAGE 检测重组蛋白表达Fig.4 SDS-PAGE analysis of cell-free extracts from recombinant E.coli

2.3 诱导条件优化

2.3.1 培养基的选择

将重组菌BL21(DE3)/pET28a-S1＇分别接种于LB、MBL 和2 × YT 培养基中进行培养和诱导表达(图5)。结果表明，在3 种培养基中E. coli BL21(DE3)/pET-S1＇均能较好生长，其在2 ×YT 培养基中菌体量达到最高，而在LB 培养基中酶活力最高(9.39 U/mg 蛋白)，因此选择LB 作为重组菌BL21(DE3)/pET28a-S1＇的培养基。

2.3.2 IPTG 诱导浓度优化

按1.5 接种方法，研究了不同终浓度IPTG 诱导对工程菌表达KRED 酶活的影响。结果表明，0.8 mmol/L浓度IPTG 诱导时的酶活最高(9.47 U/mg 蛋白)，过低或过高的诱导剂浓度都不适合对酶进行诱导(图6A)。

图5 培养基对重组菌生长和酶活的影响Fig.5 Effect of mediums on growth and enzyme activity of the recombinant strain

2.3.3 诱导温度的优化

按1.5 接种方法，研究了20、25、30、37 和40℃等不同诱导温度对工程菌表达KRED 的影响。结果表明，30℃下诱导KRED 的酶活最高(10.28 U/mg 蛋白)(图6B)。这可能是因为降低温度诱导可以降低蛋白质合成速率，使蛋白质正确折叠以减少包涵体的产生，增加了目的蛋白质的可溶性。

2.3.4 诱导时间的优化

按1.5 方法接种和培养，加入0.8 mmol/L 的IPTG 分别诱导2、4、6、8、10、12 h。结果表明，加入IPTG 诱导8 h 时酶活达到最高(11.49 U/mg 蛋白)，8 h 后酶活开始下降(图6C)，下降原因可能是诱导后期由于蛋白质聚集形成包涵体或者细胞内蛋白酶降解重组蛋白质等导致了酶活的下降。

图6 工程菌诱导条件优化Fig.6 Induction optimization of the recombinant strain

2.4 双重组菌全细胞还原制备S-CHBE

以4-氯乙酰乙酸乙酯(COBE)作为底物，利用工程菌在细胞水平上进行转化反应，以此来检测工程菌转化活性。色谱分析结果显示，在未添加NAD(P)H等辅酶的条件下，BL21(DE3)/pET28a-S1＇耦合E.coli BL21(DE3)/pET28a-gdh 可高效催化COBE 生成S-CHBE，而阴性对照的大肠杆菌未显示转化活性。双重组菌耦合转化10 h，产物摩尔得率达92.1%，底物COBE 基本转化完全，反应过程中产物的对映体过量值(e. e. )始终保持100%(图7)。这表明我们设计并克隆的重组工程菌菌体细胞具有高效的手性选择还原COBE 生成S-CHBE 的能力，转化过程无需添加辅酶，这非常有利于工业化生产。

图7 双重组菌耦合不对称还原COBE 制备S-CHBEFig.7 Reduction of COBE to S-CHBE by E. coli BL21(DE3)/ pET28a-S1＇ and E. coli BL21 (DE3)/ pET28a-gdh

3 讨论

S1 羰基还原酶(S1-KRED)属短链醇脱氢酶家族，是Yasohara 等人从C. magnoliae AKU4643 分离得到的，显示出高效、高选择性催化COBE 合成SCHBE 的能力，目前对该基因的外源表达水平的研究主要集中在表达系统(启动子强度、载体性质)及表达条件等方面［6，8］。为了进一步提高该酶在大肠杆菌中的表达效率，本研究在不改变氨基酸序列的情况下利用JCat 软件对S1 基因序列进行E. coli 密码子偏嗜性优化，获得新的S1＇基因序列并人工合成S1＇序列，构建重组菌E. coli BL21/pET28a-S1＇而实现异源表达，经过诱导条件优化后羰基还原酶活力达11.49 U/mg 蛋白，其表达效率优于S1 基因序列，这说明密码子偏嗜性优化是一种提高外源基因表达效率的有效手段。

大多数氧化还原酶用于催化制备手性醇、羟基酸、氨基酸等重要医药中间体过程中，往往需要辅酶NAD(P)H 的参与，这些辅酶价格昂贵，从而成为了限制氧化还原酶应用的关键因素［15-16］。本研究利用重组菌E. coli BL21(DE3)/pET28a-S1＇与E. coli BL21(DE3)/pET28a-gdh 偶联不对称还原COBE 制备S-CHBE，在未添加任何辅酶的条件下实现了SCHBE 的高效还原制备，转化10h 后产物摩尔得率达92.1%，其对映体过量值(e. e. )为100%，这对提高生物催化的原料经济性，降低生物催化生产成本，实现工业化应用具有一定意义。

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