纳他霉素-蛋白质复合物制备及其抑菌效果评价

赵晔，顾沁，张延杰，周戈，徐学明

1(江南大学食品学院，江苏 无锡，214122) 2(咀香园健康食品(中山)有限公司，广东 中山，528437)3(浙江老艺人生物科技有限公司，浙江 丽水，323000)

纳他霉素(natamycin)，又名匹马霉素或游链霉素(pimaricin)，是一种多烯大环内酯类抗真菌剂，分子式为C33H47O13，分子量为665.75，是一种两性物质，分子中有1 个碱性基因和1 个酸性基因，其电离常数pKa 值为8.35 和4.6，相应的等电点为6.5，熔点为280 ℃［1］，微溶于水和甲醇，难溶于大部分有机溶剂;在水中的溶解度为50 ～100 mg/L。高温、紫外线、氧化剂及重金属等会影响其稳定性［2］。

纳他霉素是一种高效、安全、天然的抗真菌试剂，具有低剂量、高效率、抗菌作用时间长的特点，能够专性抑制酵母菌和霉菌，阻止丝状真菌中黄曲霉素的形成。1982 年7 月，美国FDA 正式批准纳他霉素可用作食品防腐剂;1997 年3 月我国食品添加剂使用卫生标准将其作为增补品种批准使用，批准使用范围为乳酪制品、肉类制品(肉汤、西式火腿)、广式月饼、糕点表面、果汁原浆表面、易发酵食品加工器皿表面、发酵酒、沙拉酱等［3］。纳他霉素的抑菌机理为溶解的纳他霉素与细胞膜中的甾醇类物质结合，改变细胞膜的通透性，从而达到抑真菌效果［1］。因而低水溶性就成为限制纳他霉素抑真菌效果的主要因素［4-5］。

蛋白质作为一种生物大分子，能与多种小分子物质，如有机小分子染料、药物、无机离子等形成复合物。作用方式主要是次级键，如氢键、范德华力、疏水作用力等。据报道，蛋白质如β-乳球蛋白(β-LG)可与多种疏水小分子及两性物质形成复合物，有效地提高疏水分子的水溶性及稳定性［6］。本文主要制备纳他霉素及大豆分离蛋白的复合物来提高纳他霉素的溶解性，并对复合物的抑菌效果进行评价。

1 材料与方法

1.1 材料及设备

纳他霉素(含量95%)，浙江银象生物科技有限公司;大豆分离蛋白(SPI)，江南大学食品学院提供。

菌种:啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae Hansen)青霉(Penicitlium sp. )、黑曲霉(Aspergilla sp. )、根霉(Rhizopus)，江南大学食品学院微生物基础实验室。

细菌采用牛肉膏蛋白胨培养基:牛肉膏3 g ，蛋白胨10 g ，琼脂20 g ，NaCl 5 g ，加水至1 000 mL ，pH 7.2 ～7.6。

酵母菌采用YPED 培养基:酵母膏10 g，蛋白胨20 g，葡萄糖20 g，琼脂20 g，加水至1 000 mL，自然pH。

霉菌采用PDA 培养基:马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂12 ～15 g，蒸馏水1 000 mL，自然pH。

MEB 液体培养基:麦芽浸膏20 g，加双蒸水至1 000 mL，调pH 至6.9 ±0.2。上述培养基121 ℃高压灭菌20 min，备用。

TU1901 紫外可见分光光度计，北京普析通用;ZHWY-211C 恒温振荡器，上海智城分析仪器制造有限公司;ARA520 电子精密天平，美国OHAUS(奥豪斯)公司;生化培养箱;超净工作台(HS-3)。

1.2 实验方法

1.2.1 标准曲线的绘制

取适量纳他霉素，加甲醇溶解，配制成一定的浓度，另取适量的大豆分离蛋白配成溶液，分别用紫外分光光度计在200 ～400 nm 扫描，得紫外光谱图。精密称取纳他霉素对照品100 mg，置于100 mL 容量瓶中，加适量甲醇∶水∶乙酸(60∶40∶5)溶液溶解并定容至刻度，作为储备液。精密量取储备液，用甲醇∶水∶乙酸(60∶40∶5)溶液分别稀释为0.5、1、2、3、4、5、6、10、20 mg/L。在λ319nm和λ303nm处测定吸光度，用双波长法绘制标准曲线［7］。

1.2.2 纳他霉素-大豆蛋白复合物制备方法

(1)0.5 g 纳他霉素溶于80 mL 水(用4 mol/L NaOH 调pH 至11.5);(2)大豆分离蛋白溶于去离子水5% (w/w);(3)5 mL 上述大豆分离蛋白溶液加入80 mL 纳他霉素溶液中搅拌一定时间;(4)用4 mol/L HCl 调pH 至5.8，加去离子水至100 mL。

1.2.3 大豆蛋白水解及水解度测定

水解样品通过木瓜蛋白酶限制水解大豆分离蛋白制备:用去离子水配制1% SPI 溶液，室温下搅拌2 h，使其充分水合，80 ℃下水浴10 min 后降温至55 ℃，用NaOH 溶液调pH 至7.0，加入木瓜蛋白酶(E/S=3 %)开始酶解，在不同时间下取样，样品在90 ℃灭酶5 min，冷却至室温，调pH 至7.0，用pHstat 法测定大豆蛋白水解度，4 500 r/min 离心20 min后取上清液冻干。

1.2.4 评价指标及测定方法

纳他霉素或复合物在pH =5.8 ～6.0 平衡溶解24 h 后，4 000 r/min 离心20 min，取上清液稀释一定倍数后用双波长紫外分光光度法测定溶解度。

1.2.5 纳他霉素-蛋白质复合物抑菌圈测定［8］

取直径6 mm 的圆形滤纸片，灭菌。吸取20 μL不同复合物样品滴到滤纸片上，无菌风干备用。将灭过菌的培养皿、培养基放入超净工作台中冷却至60℃后倒平板。每皿约20 mL，水平放置。用移液枪取0.2 mL 菌悬液加在平板上，用涂布棒均匀涂开。无菌镊子夹取已风干的滤纸片放在接过种的平板上。每皿放3 片，呈正三角形。每个样品做3 组平行，放入培养箱中，倒置培养24 h。拍照记录并测量抑菌圈大小。

1.2.6 纳他霉素-蛋白质最小抑菌浓度测定

1.2.6.1 纳他霉素及纳他霉素-大豆分离蛋白原液的制备

纳他霉素原液:准确称量0.032 g 纳他霉素溶于10 mL 无菌水，制得3 200 mg/L 纳他霉素溶液悬浊液，吸取1 mL 上述溶液稀释100 倍，制得32 mg/L 纳他霉素原液，记为溶液①。

纳他霉素-SPI 复合物原液:准确称量0.032 g 纳他霉素溶于10 mL 无菌水，用4mol/L NaOH 溶液调pH 至11.5 ～12，加0.32 mL 5%(w/w)SPI 溶液，反应一段时间后调pH 至5.8，制得含纳他霉素3200 mg/L 溶液，吸取上述溶液1 mL 稀释100 倍，制得32 mg/L 纳他霉素-SPI 原液，记为溶液②

1.2.6.2 试管二倍稀释培养

取7 只灭菌的13 mm×100 mm 试管，编号为1 ～7，其中7 号为对照管。每只试管分装1 mL 灭菌的MEB 液体培养基。按照表1 进行操作。28 ℃培养3 d，观察记录结果。终点判定标准:肉眼观察法。按以下标准记录MIC 结果，+ + +:菌生长较生长对照轻度减少;+ +:菌生长较生长对照明显减少;+ :只有薄层菌生长;—:清晰透明。记录结果，以清晰透明组对应的抑霉菌剂浓度为最小抑菌浓度，即MIC。

表1 试管二倍稀释法操作表Table 2 Operation method of two times dilution method

2 结果与讨论

2.1 紫外光谱扫描图

如图1，纳他霉素及纳他霉素-大豆蛋白复合物的紫外光谱显示，在λ 为290，303，319 nm 处有3 个尖锐的最大吸收峰，这是纳他霉素结构中的环状四烯结构产生的共轭峰。大豆蛋白的紫外光谱显示，在λ280nm附近有宽峰。大豆蛋白在纳他霉素最大吸收波长303nm，319 nm 处的吸收值分别基本没有变化，且与纳他霉素的吸收值相差较大，因此可以选定303 nm，319 nm 做为纳他霉素含量测定波长，在此处蛋白质吸收的ΔAλ1-λ2≈0，可以最大限度地减少蛋白质吸收的干扰。

图2 为纳他霉素的标准曲线，得到纳他霉素的一元线性回归方程为:ΔA = 0.0213C - 0.0009，R2=0.9998，式中:ΔA 为303 nm、319 nm 吸光度差值;C为浓度，μg/mL。结果表明，纳他霉素吸光值差值与质量浓度在0.5 ～20 mg /L 内呈良好的线性关系。

图1 纳他霉素、纳他霉素-大豆蛋白复合物及大豆蛋白紫外光谱图Fig.1 UV spectra of natamycin，natamycin-SPI and SPI

图2 双波长紫外分光光度法标准曲线Fig.2 The standard curve of double wavelength UV spectrophotometry

2.2 纳他霉素-大豆蛋白复合物制备条件优化

2.2.1 大豆蛋白水解度对纳他霉素-大豆蛋白复合物溶解度的影响

分别取方法1.2.3 制得的水解度DH% =0，2.5，5.43，6.24，6.76，7.43，8.21，9.01 的大豆分离蛋白制备复合物，所得复合物的溶解度结果见图3。

图3 蛋白质水解度对复合物溶解度的影响Fig.3 Influence of different hydrolysis degree of SPI on solubility of natamycin-SPI complex

由图3 可知，蛋白质水解度与复合物中纳他霉素溶解度变化的P ＞0.05，差异不显著，总体趋于平稳。因此使用商品性SPI 直接制备蛋白质纳他霉素复合物就工艺而言更简单。

2.2.2 反应时间对纳他霉素-大豆蛋白复合物溶解度的影响

反应时间分别为10，30，60，90，120，150 min，用方法1.2.2 制备复合物，所得复合物的溶解度结果见图4。

图4 不同反应时间对复合物溶解度的影响Fig.4 Influence of different reaction time on solubility of natamycin-SPI complex

由图4 可知，随着反应时间增加，纳他霉素溶解度逐渐升高，当反应时间大于120 min 时，复合物溶解度变化不大，趋于平稳。因此选取120 min 作为反应时间。

2.2.3 反应温度对纳他霉素-大豆蛋白复合物溶解度的影响

选取反应温度分别为30，40，50，60℃按方法1.2.2 反应120 min 制备复合物，所得复合物的溶解度结果见图5。

图5 不同反应温度对复合物溶解度的影响Fig.5 Influence of different reaction temperature on solubility of natamycin-SPI complex

由图5 可知，反应温度对纳他霉素溶解度影响较大，随着反应温度的升高，纳他霉素溶解度升高，考虑到纳他霉素热稳定性较差，尤其在大于100℃环境中会很快失活［9］，选取40℃作为反应温度。

2.2.4 反应浓度对纳他霉素-大豆蛋白复合物溶解度的影响

纳他霉素浓度分别为1，2.5，5，7.5，10，12.5 g/L，以m(纳他霉素)∶m(大豆蛋白)=2∶1 添加大豆蛋白溶液，按方法1.2.3 在40 ℃下反应120 min 制备复合物，所得复合物的溶解度结果见图6。

图6 不同底物浓度对复合物溶解度的影响Fig.6 Influence of different concentration on solubility of natamycin-SPI complex

由图6 可知，随着反应体系中纳他霉素浓度的增加，复合物溶解度逐渐升高，当纳他霉素浓度大于5 g/L 时，复合物溶解度又随之降低。选取5 g/L 作为反应浓度。

2.2.5 不同配比对纳他霉素-大豆蛋白复合物溶解度的影响

以纳他霉素5 g/L 作为反应浓度，分别以纳他霉素∶蛋白质(N∶SPI)=10∶1，8∶1，4∶1，2∶1，1∶1，1∶2 的配比添加5% (w/w)大豆分离蛋白溶液，按方法1.2.2 在40 ℃下反应120 min 制备复合物，所得复合物的溶解度结果见图7。

图7 不同配比对复合物溶解度的影响Fig.7 Influence of different proportioning on solubility of natamycin-SPI complex

由图7 可知，随着N∶SPI 的增大，复合物溶解度增大，但当N∶SPI 大于4∶1 时，复合物溶解度不再随配比增大而增大，因此选取纳他霉素∶蛋白质=4∶1作为反应配比。

2.2.6 反应pH 值对纳他霉素-大豆蛋白复合物溶解度的影响

反应pH 分别设置为9.5，10，10.5，11，11.5，12，12.5，13，以纳他霉素5 g/L 作为反应浓度，以纳他霉素∶蛋白质(N∶SPI)=4∶1 的配比添加5%(w/w)大豆分离蛋白溶液，按方法1.2.2 在40 ℃下反应120 min 制备复合物，所得复合物的溶解度结果见图8。

图8 不同反应pH 值对复合物溶解度的影响Fig.8 Influence of different reaction pH on solubility of natamycin-SPI complex

由图8 可知，反应pH 对复合物溶解度影响较大，在反应pH ＞11.5 时，复合物溶解度均较高，考虑到纳他霉素在pH ＞12 的环境中易分解失活，选取pH=11.5 作为反应pH。

2.3 纳他霉素及纳他霉素-大豆蛋白复合物的抑菌圈

纳他霉素及纳他霉素-大豆蛋白复合物对霉菌和酵母抑制活性的测定结果如表2。由表2 可以看出，以纳他霉素及纳他霉素-大豆蛋白复合物对黑曲霉、青霉、根霉及啤酒酵母的抑菌圈直径分别比较，经显著性分析，P 值分别为0.000 5、0.000 3、0.000 05、0.005，在P ＜0.05 水平上有显著性差异。

表2 纳他霉素、纳他霉素-大豆分离蛋白复合物的酵母菌抑菌圈比较(单位:mm)Table 2 Inhibition zone of natamycin，natamycin-SPI

2.4 纳他霉素及纳他霉素-大豆分离蛋白复合物的最小抑菌浓度

如表3 培养结果所示，霉菌或酵母总数为104～105个/mL 时，纳他霉素-大豆分离蛋白复合物对啤酒酵母的最低抑菌浓度是2 mg/L，对青霉的最低抑菌浓度是2 mg/L，对根霉的最低抑茵浓度是4 mg/L，对黑曲霉的最低抑茵浓度是2 mg/L，比纳他霉素的最小抑菌浓度降低1 倍。

表3 试管二倍稀释法培养结果记录Table 3 Results recorde of minimum inhibitory concentration

3 结论

纳他霉素-大豆蛋白复合物对纳他霉素的增溶效果显著，经过制备条件的优化，在一定配比反应一定时间后，溶解度能够提高16 倍，达到1 600 mg/L;同时，在此制备条件下得到的纳他霉素-大豆蛋白复合物的抑菌效果好于纳他霉素的抑菌效果，最小抑菌浓度降低1 倍。

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