角膜内皮细胞形态学的研究进展

杜 飞(综述)，毕燕龙(审校)

同济大学附属同济医院眼科，上海 200065

CEC 位于角膜最内层，是人体上唯一可被窥视的活体内皮细胞，其特定的单层六角形细胞镶嵌结构和细胞内主动液泵功能可维持角膜的透明及角膜厚度的相对恒定。当其受外伤、疾病或手术等损伤后，缺失的细胞区域由周围细胞增大、扩展和移行来填补，而细胞移行可导致平均细胞密度(cell density，CD)降低和细胞形态改变［1］。本文对CEC的检测及分析做一综述。

1 CEC 检测方法

1.1 显微镜

显微镜以显微原理分为光学显微镜与电子显微镜。目前光学显微镜可把物体放大1500 倍，分辨的最小极限达0.2 μm。电子显微镜可把物体放大到200 万倍。结合各种电镜样品制备技术，可对细胞进行多方面结构或结构与功能关系的深入研究。

1.1.1 光学显微镜

裂隙灯显微镜 弥散照明法可对角膜行全面观察。直接焦点照明法可对细节如角膜后沉积物(KP)行精细观察。用镜面反光照射法时可观察角膜前后细微变化如角膜内皮的纹理变化。后部反光照射法便于发现CEC 水肿。新一代产品可对角膜上皮、基质神经走形、角膜缘血管网及CEC 细节行更为精确的观察，同时配备高清数码照相功能［2］。

共聚焦激光扫描显微镜(Confocal Laser Scanning Microscope，CLSM)1990年Cavanagh 等首次将光学共焦显微镜应用于临床。因无创、动态的优点在临床和研究领域迅速得到广泛应用。CLSM用激光作为光源，提高了分辨率，增加了扫描深度，能实时、活体和三维空间从细胞水平对角膜各层结构定性分析研究。CLSM 下正常CEC 呈六边形结构，边界清晰，排列规则，细胞透光性较一致，细胞核很难观察到［3］。60 岁以上受检眼中CEC 可见小块无细胞暗区，病变CEC 肿胀，失去多边形结构，边界模糊，细胞间隙增宽，细胞间可见大小不一，形态各异的KP，并可突破细胞间连接，出现细胞缺损区。

1.1.3 角膜内皮显微镜(corneal specular microscopy，CSM)

目前有非接触及接触式两种应用于临床。CSM 可观察角膜多象限的CEC，可与视频打印机、电脑、Cell Count、IMAGE net、Cell Analysis 等软件配置分析处理图像，能全面反映CEC 的状态，使CEC 形态学研究有了很大飞跃。然而，CSM 也有其不足，Cheung［4］研究证明CSM 检查存在着误差。不同显微镜之间存在着差异［5］。在图象分析上计算机识别细胞的界限存在一定误差［6］;不能对坏死细胞进行剔除处理等。在图像欠清晰时会将单个CEC 标记成两个或数个细胞，在所选计数区域的边缘，常常将不完整的单个细胞计算在内，错误的描绘其边界，甚至拍摄到的CEC 混浊不清或大片暗区也被错误地自动计数。

1.1.3 电子显微镜(electron Microscope，EM)

透射电子显微镜 (transmission electron Microscope，TEM)的分辨率为0.1～0.2nm，放大倍数为几万～几十万倍。能提供极微细材料的组织结构、晶体结构和化学成分等方面的信息。扫描电子显微镜(scanning electron microscope，SEM)利用电子束扫描样品表面获得样品信息，能产生样品表面高分辨率的三维图像，鉴定其表面结构。SEM 下正常CEC 为单层，细胞体积大而扁平，多边形，表面微绒毛丰富，细胞间伸出足突相互连接［7］，细胞边界的交叉角约为120°。TEM 下细胞核呈长椭圆形，核质比高，核明显偏向游离面，核仁大［8］，异染色质沿核膜分布，常染色质散在于核内，胞浆内见丰富完整的线粒体、内质网、高尔基体等结构。

1.2 眼前段光学相干光断层扫描仪(anterior segment optical coherence tomography，AS -OCT)

AS-OCT 是一种非接触、方便快捷、分辨率高的眼前节扫描技术，其轴向分辨率最高＜25 μm，可获得直径达16 mm、最深6 mm 的眼前节组织断层细节，既可进行定性分析，又可定量检测。可观察角膜精确的结构，尤其病变时角膜结构的具体变化，如角膜后表面囊泡［9］。

2 CEC 形态学相关参数

2.1 中央角膜厚度(Central corneal thickness，CCT)

角膜厚度可反映整个角膜的功能，中央部最薄，平均为500 μm，周边部约为1000 μm 左右。研究表明，角膜厚度、CEC 数量和形态以及角膜内皮渗透系数有很好的相关性，而CCT 与CD 之间无相关性。动态观察角膜厚度对CEC 损伤程度及其功能及预后评定有非常重要的意义。角膜厚度增加30%即出现明显混浊;增加50%以上出现不可逆性混浊［10］;角膜厚度持续增加表明CEC 损伤呈进行性加重。

2.2 CEC 形态

正常CEC 呈六边形，厚4～5 μm，宽18～20 μm，平均表面积约为400 μm2，大小相等，分布规则，细胞边界的交叉角约为120°，CEC 受损或发生移行，这个角度即发生改变。随着年龄增长，CD 下降，细胞形态随之变化，大小不等、多形性细胞增多，平均面积增大，六角形细胞减少。细胞形状和大小不均随年龄增加轻度改变。角膜水肿、后弹力层皱褶形成时可见内皮内呈波浪状或条状隆起或凹陷。角膜内皮层类滴状赘疣为CEC 的退行性改变，在60、70、80 岁正常人出现的百分比分别为6%，12%，29%。正常细胞边界呈清晰的暗的直线，有时可见几个细胞出现双边，可能是光学上的阴影，无病理学意义［11，1］。

2.3 暗结构及角膜后表面的形态

CSM和CLSM 检查CEC 时，相邻细胞之间和细胞内可发现大小不等的暗结构(暗区)或亮结构［12］，小的比一个细胞还小，大的可以成片。暗区由死亡细胞或角膜后表面不光滑的隆起如滴状和类滴状等在CEC和房水交界面的反光形成［13］。较大的暗结构，多发生在CEC 病变时如后弹力膜结节，少数原因不明。亮结构有可能为内皮细胞核的反光，前房炎症时在细胞表面的沉着物可形成高反光点。角膜内皮后表面为CEC 与前房水相接触的分界线，CLSM 下呈一暗色的条带，内皮细胞表面光滑，镜下呈直线形。当CEC 受损时，细胞表面产生不规则的暗的分界线，呈波浪型或锯齿形。

2.4 CD

婴幼儿期细胞通过有丝分裂增殖，总数约为90～100 万个，新生儿期CD 约为3500～4000个/mm2，出生后第一年CD 减低最快，以后速率降低，25 岁以后降低更明显，每年以0.5% 的速度递减［14］，成人阶段约为2500～3200个/mm2。成人后CEC 则失去增殖能力，损伤区域由邻近细胞扩展、移行来覆盖，60 岁以后，CD 减少与年龄无相关性。当CD 下降至1000个/mm2时，为内眼手术后发生失代偿的临界值。在一定的界限内CD 与整体细胞离子泵功能之间的关系不明显，不能充分显示CEC 功能状态［14］。中央CEC 表现出较强的衰老相关的属性，兔CEC 培养发现角膜中央部CEC 倍增时间长于周边部而增殖力则弱于周边部，推测具干性属性细胞可能位于周边［15］。角膜中央和周边部CD 均随年龄减少，老年人周边部减少更明显。

2.5 平均细胞面积(Save)，最大细胞面积(Smax)，最小细胞面积(Smin)

Save随CD 下降而增大。Smax及Smin与Save差异越大，代表细胞变异越明显。研究发现，CD 降低到正常的25%～45%，六角形细胞数目小于30%～40%及细胞面积增加3～4 倍可导致CEC 功能失代偿［16］。

2.6 周长、最长径、最短径

细胞形态学参数的改变能反映早期CEC 的功能障碍。周长和最长径反映细胞变化时的拉长程度;细胞最长直径或面积测量值等如果过大，说明细胞有移行扩张现象，其功能必然受损，目前临床仪器尚未能反应这些指标。

2.7 细胞形状H%

反应CEC 偏离标准六边形结构的程度，为衡量细胞损害的灵敏指标。但其与CD 在整体CEC 功能状态中所起的作用尚需进一步研究。形态系数Fc(Fc=4πA/Pe2)(A 为面积，Pe 为周长)，能准确反映细胞圆整程度，正圆形为1.0，正六边形为0.907［17］。

3 CEC 形态学影响因素

3.1 遗传

Makiti 认为遗传因子决定CD 的成分大于环境影响，遗传因子可通过决定出生时CEC 数目和角膜最终面积来决定CD［18］。CEC 数量和CD 存在种族差异、个体差异，并随年龄而变化。西方成人CEC每年减少0.5%～0.6%，中国和印度成人为0.3%［19，20］。可能与角膜生长过程中CEC 的重新分配有关，青少年阶段CD 下降更明显。左右眼无明显差异，性别对CD 无影响。另外，CD 也存在地域差异，亚洲地区CD 高于其他地区［19，20］。

3.2 眼部疾病

3.2.1 近视

中低度近视眼CEC 各项检查结果与正视眼无显著差异。高度近视者CD 减少，与角膜厚度和眼轴长度无相关性，可能与以下因素［21］有关:(1)早期细胞有丝分裂增强，角膜直径增大;(2)玻璃体退行性变影响房水循环及代谢进而影响CEC 的营养;(3)眼轴增大，角膜也会发生伸展，影响CD。这种状态下，CEC 更易受到外伤、眼内手术等各种理化因素的损伤而出现形态变异。此外佩戴角膜接触镜、提高视觉质量的手术(分子激光、晶状体眼人工晶状体植入等)增加了CEC 损伤的机会。研究儿童和青少年近视组发现，不同程度的近视角膜厚度无明显差异，Save与近视程度具有相关性。

3.2.2 角膜原发病变

(1)由原发性角膜内皮功能紊乱导致的角膜营养不良称为角膜内皮(后部)营养不良，包括Fuchs角膜内皮营养不良(Fuchs endothelial corneal dystrophy，FECD)、多形性角膜后层营养不良(posterior polymorphous corneal dystrophy，PPCD)、先天性遗传性角膜内皮营养不良(congenital hereditary endothelial dystrophy，CHED)。CEC 功能及形态异常、后弹力层后部可见由CEC 分泌的异常胶原等为其共同特征。FECD 以CEC 形态缓慢持续改变、细胞数量不断减少及晚期出现角膜滴状赘疣为特点［22］，内皮镜可见后弹力层增厚，出现多行赘疣;CEC 变大，多形，被赘疣排挤、推压形成中间亮点周围暗区。PPCD 特征性表现为CEC 上皮样改变，包括CEC 出现复层增生并分泌一系列细胞角蛋白而这些角蛋白表达于角膜上皮细胞。CHED 由CEC 发育不全或变性、功能减退所引起，病理特征:细胞形态异常，可见异常的多核细胞。(2)Peters 异常以CEC和后基质层和后弹力层缺损的缺损为特征，角膜中央部有先天性白斑，中央虹膜粘连到白斑的周边部，虹膜与角膜粘连常位于颞侧虹膜睫状区。角膜可出现水肿，周边部角膜比较透明。(3)ICE综合征CEC 形态在病变早中期呈“风筝样”、晚期呈“上皮细胞样”特征性变化［23］;细胞核呈高反光或双核，CD和H%随病程逐渐下降，AVG 增大［24］。

3.2.3 青光眼

(1)原发性急性闭角型青光眼高眼压可直接损伤CEC，房水循环阻滞使房水处于低氧状态影响细胞代谢。细胞损伤与急性发作的持续时间有密切关系，表现为细胞面积增大和CD 下降，细胞受损程度与眼压密切相关。(2)原发性慢性闭角型青光眼CD 减少与其急性发作史有关。(3)原发性开角型青光眼和正常对照组相比，CD 密度显著减少，正常眼压性青光眼患者的CD 则不降低［25］。

3.2.4 白内障

目前多认为老年性白内障发病机制是晶状体上皮细胞发生退行性变，细胞膜通透性增加酶活性改变、细胞数量减少凋亡细胞增多。CEC 与晶状体上皮细胞处于同一房水环境中，晶状体上皮细胞凋亡时可能影响到CEC 正常代谢。老年性白内障进展程度与CEC 密度和形态改变有一定相关性，随着白内障进展程度的加重，CD 降低，CV 增大，H%降低［26］。

3.2.5 葡萄膜炎

前葡萄膜炎炎症急性期CEC 出现暗区，彼此间相互融合，CEC 形态发生改变，Save增大，SD 减少，细胞暂时性功能障碍。恢复期KP 数量减少，CEC表现为亮度不均的残缺细胞形态;炎症平息后，细胞间隙渐清，细胞暗区逐渐消退，细胞轮廓逐渐显现;炎症消退后CD 可能未见统计学意义上的改变，但是细胞形态学的改变不可逆转;CEC 损害与发病频数呈正相关，与病程及疾病严重程度密切相关［27］。

3.2.6 角膜内皮炎

这是一种病因不明的CEC 急性非化脓性炎症，以深基质水肿及角膜后沉着物(KP)为特征，CEC有不同程度损害，形态发生异常。CLSM 下CEC 前可见斑片状大小不等的高反光结构，部分可见“疣状物”，病变区CEC 水肿、剥脱，变性呈无结构暗区，细胞呈多形性改变;CEC 间炎症细胞浸润［28］，细胞间可见大小不一，形态各异的KP，并可突破细胞间连接，出现细胞缺损区。

3.3 糖尿病

高血糖下兔CEC 肿胀，表面出现裂纹，细胞间隙增大，连接疏松，微绒毛消失。形态学改变与葡萄糖浓度基本成正相关。糖尿病患者长期房水中葡萄糖的含量升高或不稳定，CEC Na+-K+-ATP 酶活性降低，影响角膜葡萄糖代谢，导致乳酸浓度升高，产生角膜基质代谢性酸中毒，进而引起CEC 形态和功能的改变，修复和代偿能力下降，对眼部疾病、损伤及手术缺乏抵御和耐受能力，细胞易丢失。糖尿病人的CEC 形态改变具体表现为CCT、CV 增加，SD和H%减少［29］。

3.4 手术和外伤

内眼手术对CEC 损伤包括热灼伤、震荡伤、机械损伤及化学损伤等。术者熟练程度、手术时间的长短、手术技巧、仪器的性能及眼内外光、电、冷凝等直接或间接影响CEC，术中前房灌注液和高浓度的化学物质刺激、玻璃体的溢出，术后前房无菌性渗出和高眼压均对内皮产生影响。内眼手术后，SD 每年丢失率显著增加。眼外伤时机械性外力对CEC的挤压，前房积血，继发性色素膜炎影响，均导致CD和H%降低，造成CEC 屏障功能和主动运输功能的破坏。角膜穿通伤时，CEC 经创面直接丢失。

3.5 角膜接触镜

慢性缺氧和炎症反应导致乳酸堆积和CO2水平增高，PH 降低，引起细胞面积增大、CD、H% 减少。聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)硬性角膜接触镜、日抛型软性及软性亲水的水凝胶角膜接触镜均可引起CEC 形状改变细胞大小不均的改变，如随着戴镜时间增加，CEC 面积大小变异明显增加，细胞间暗区明显，角膜变薄等。屈光优良、舒适、轻薄、高透氧和少沉积是这一领域未来研究方向［30］。

3.6 药物

很多滴眼液和眼内注射药物均可对CEC 造成不同程度的损伤。部分抗青光眼滴眼液中含损伤CEC 的氯铵［31］。皮质类固醇对角膜外伤有减轻水肿作用的同时也对CEC 造成损伤，使CEC 变异系数变大，H%变小［32］。有学者认为，内眼术后硅油进入前房可能影响房水对CEC 营养供应，角膜新陈代谢降低。另外，硅油和CEC 接触会使细胞生理及形态发生变化，出现异形细胞和暗、亮结构变异，也可见到后弹力层赘生物［33］。C3F8等眼内填充气体可产生一过性细胞毒性。肾上腺素、庆大霉素局部应用，利多卡因前房内注射都可不同程度损伤CEC。

3.7 其他

户外工作者SD 减少可能与紫外线辐射增加有关［34］。原发性高血压患者可能H% 下降、CV增大［35］。

不同的分析细胞形态学技术手段为临床CEC评估提供了多种选择方案。形态学定量和定性分析对了解CEC 功能状况和代谢进程，进而指导眼科疾病的治疗、判断手术预后、预测术后修复情况等都极为重要。各种检查技术开发、现有检查技术升级及各种检查技术的合理交叉应用，综合评估是这一领域未来的发展方向。

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