胃癌组织中 NF-κ B、P73表达与幽门螺旋杆菌感染的相关性研究

魏微微,王亚洲,孟凡石

(佳木斯大学临床医学院,黑龙江 佳木斯 154003)

目前幽门螺旋杆菌被公认感染是可以增加细胞的增殖活性,并且通过使其抑癌基因失活及其癌基因激活从而使胃黏膜上皮细胞发生癌变。在胃癌机制分子生物学水平上,核因子κB(nuclear factor kappa B,N F-κ B)是一类具有和某些基因上启动因子区固顶核苷酸序列结合而启动基因转录的功能性蛋白质,因此诸多因素可以使 NF-κB促进基因转录活性增强,导致某些控制细胞转化靶基因转录增强,并且诱发肿瘤的发生。王维[1,2]等所应用免疫组化方法检测检测了有41例胃癌和25例相应非癌组织中 NF-κ B的表发达,而正常显示无论是胃黏膜还是肠型化生以及不典型增生和胃癌组织中,阳性率逐渐升高 ,同时在低分化期、进展期、还有有淋巴结转移和浸润至浆膜的胃癌组织中,增高尤为明显。而P73蛋白是在1997年发现的和 P53具有十分相似的结构和功能的新基因,近年来研究表明 P73在肿瘤的发生、发展、预后等方面起重要作用,国内国外研究过程中发现,进一步分析P73的过表达与胃癌临床病例参数之间的关系有所发现,由于肿瘤体积增大,浸润深度增加及淋巴结转移,P73mRN A表达有越加增高趋势。许许多多的资料表明 ,NF-κ B、P73与肿瘤的发生发展、浸润和转移以及肿瘤耐药问题有着紧密的相关。对于 Hp与 N F-κB、P73表达两者之间的相关性研究国内外尚无研究,进一步探讨 Hp感染诱发胃癌发生的机制,并进一步研究两者在胃癌发生发展中的作用和意义及其与胃癌生物学行为的关系。

1 材料与方法

1.1 试验对象及分组

选取 2012-01～ 2013-03佳木斯大学附属第一医院普外科胃癌手术住院病人100例 ,其中男60例,女40例。入选条件:①年龄 30～ 85岁;②术前未经过化疗、放疗、生物治疗;③所有病例均采用:标准根治术,标准根治术是胃切除范围为全胃2/3以上,淋巴结清除范围为 D2的清除术 ,适应证是T1中直径 ＞ 2.1cm、N1(+ )和原发癌为 T2～ T3、淋巴结转移为 N0～N2(+)者,术前、术中检查无腹膜转移与肝转移,进行 D2清除术可获 A级 (绝对 )B级 (相对 )根治术。所有病例均由有经验的病理医师进行印象观察,并经病理检查证实。

1.2 实验方法

标本经 10%福尔马林固定,常规脱水,石蜡包埋,4 μm厚连续切片,选取染色较好的切片进行病理复查及免疫组化检测。临床病理诊断为高分化腺癌;中分化腺癌;低分化腺癌;浸润出浆膜;有淋巴结转移者;无转移者。获取癌旁正常组织,作为对照。

1.2.1 HP检测:Warthin- Starry银染法观察 HP感染情况。

1.2.2 P73,N F-κ B的检测:SupervisionTM二步法免疫组化染色。

1.2.3 结果判定

(1)结果判定标准:HP感染:Warthin-Starry银染法观察 Hp感染情况,若有 Hp感染为棕黑色。

N F-κB判定标准:NF-κ Bp65以细胞浆中出现棕黄色细颗粒状沉淀,染色强度高于背景非特异性染色者为阳性。

P73判定标准:P73染色阳性信号为棕红(褐)色,定位于细胞核和细胞浆,染色强度高于背景非特异性染色者为阳性。

(2)结果分级:HP感染结果分级:W-S染色分级标准:0级:未见细菌;1级:偶有细菌;2级细菌数目介于1级和 3级之间;3级:所有视野内见大量细菌。

NF-κB判定结果分级:高倍镜下取10个不同视野 ,每个视野计数100个细胞,取其平均值,按阳性细胞所占百分率,并且结合染色强度分析。参照许良中等[3]制订的判断标准进行打分,先将染色强度打分(A分):0分为无色,1分为淡黄色,2分为棕黄色,3分为棕褐色。然后将阳性细胞所占的百分打分 (B分):0分为阴性,1分为阳性细胞 ＜5%,2分为阳性细胞在 5%～ 25%,3分为阳性细胞在25%～50%,4为阳性细胞＞50%。根据两项指标积分数 (积分=A×B)高低分为:0、1分为阴性(-),2、3分为 弱阳性(±),4、 6分为阳性 (+);8、9、12分()为强阳性。以-和±为表达阴性(-),+和为表达阳性(+ )。

P73判定结果分级:参照文献[4],每张切片都随机选5个高倍视野 ,每个高倍视野计数200个细胞,观察阳性细胞染色强度,并且计数阳性细胞百分比,按阳性细胞数所占百分比进行打分:可分为 0分为小于 5%,1分为 5%～25%,2分为25%～50%,3分为 50%～75%,4分为大于75%。根据其染色强度进行打分:又可分为0分无色,1分浅黄色,2分棕黄色,3分棕褐色。染色强度×阳性细胞百分数可分为:9～12分为强阳性(),5～ 8分为阳性(+ ),0～4分为阴性(-)。为了方便于统计学进行分析,强阳性和阳性合并成为阳性一组。

1.3 仪器与试剂

1.3.1 主要试剂

幽门螺旋杆菌快速尿素酶试纸购于珠海克迪公司;FHIT多克隆抗体(一抗)购于英国 Abcam公司;P73鼠抗人单克隆抗体购于北京中杉公司;NF-κBp65鼠抗人单克隆抗体购于北京中杉公司;免疫组化 PV-9000试剂盒购于福州迈新生物技术有限公司。

1.3.2 主要仪器

全自动生物组织脱水机沈阳市龙首电子仪器有限公司;石蜡包埋机、冷冻台、摊片机、烤片机均为孝感市宏业医用仪器有限公司;石蜡切片德国 Microm公司。

1.4 统计学处理

采用 SPSS10.0软件包进行统计分析。采用卡方检验方法,Fisher精确概率法及 Spearman等级相关对相应资料进行分析,取0.05为检验水准。

2 结果

2.1 胃癌患者 HP感染情况

Warthin-Starry银染法观察胃癌患者的 Hp感染情况,若出现棕黑色则有 HP感染,该患者列为 HP感染组,相反,为 HP感染组;两组患者进行卡方检验 (i2= 1.07,P＞ 0.05),胃癌组织中 HP感染率为66.00%,癌旁正常组织作为对照组,癌旁组织的 HP感染率21.31%,见表 1。

表1 胃癌患者 HP感染情况

2.2 胃癌患者 NF-κBp65蛋白的表达情况

N F-κ Bp65蛋白在胃癌组织中(HP感染组和非 HP感染组之和)的表达阳性率为52.39%,癌旁组织(对照组 )的表达率为4.00%,正常胃黏膜中未检出 NF-κBp65蛋白,HP感染组患者 NF-κ Bp65蛋白表达阳性率为31.81%,非 HP感染组患者 NF-κ Bp65蛋白表达阳性率为20.58%。HP感染组、非 HP感染组和对照组的 P73蛋白表达情况(i2= 13.77,P ＜ 0.05),见表 2。

表2 胃癌患者 NF-κBp65蛋白表达情况

2.3 胃癌患者 P73蛋白的表达情况

P73蛋白在胃癌组织中(HP感染组和非 HP感染组之和 )的表达阳性率为52.50%,癌旁组织(对照组)的表达率为0%,正常胃黏膜中未检出 P73蛋白,HP感染组患者 P73蛋白表达阳性率为34.85%,非 HP感染组患者 P73蛋白表达阳性率为17.65%。HP感染组、非 HP感染组和对照组的 P73蛋白表达情况 (i2= 22.23,P＜0.05),见表3。

表3 胃癌患者 P73蛋白表达情况

3 讨论

胃癌是消化道系统常见恶性肿瘤之一,是占居我国癌发病和死亡率最高的[5],而且是逐年上升不断的增长趋势,对胃癌研究已经深人到多种基因突变和蛋白分子表达。癌细胞分裂增殖越旺盛,以致胃癌的恶性生长和浸润以及转移越快。

幽门螺杆菌是全世界范围乃至全球相对比较高感染率的慢性感染性致病菌之一,全世界以有50%之上的人口感染HP,据资料显示,HP的感染率达为40%～80%为慢性胃炎患者,而且在慢性活动性胃炎患者中可达90%以上为幽门螺杆菌感染,胃溃疡患者感染率也可达60%～100%,胃癌患者的感染率则为43%～78%。胃部疾病的发生、发展都跟幽门螺杆菌的感染有着密相关,并且其中大量 HP是诱发胃癌形成的重要危险因素[6]本研次究结果显示各组 HP感染率分别为:胃癌组织中 HP感染率 66.00%,癌旁组织 HP感染率为21.31%,正常胃黏膜无 HP感染。

3.1 NF-κ Bp与胃癌发生的关系

核转录因子 NF-κ B的失控而导致的,N F-κB在肿瘤中的异常激活可能是肿瘤细胞抗凋亡的主要途径之一[8,9,15]。同时 N F-κ B还通过非凋亡的形式来促进肿瘤的形成:即也可通过激活原癌基因 c-myc及 cyclinD1直接刺激增生。HinzM等实验研究发现,核转录因子 N F-κ B的靶基因是细胞周期素 cyclinD1,cyclinD1的转录可被 N F-κ B启动 ,可使 Gl/G向 S期过渡,以致细胞增殖,最终使细胞向恶性转化、癌变。

实验研究过程中,N F-κ Bp65在52例中有 HP感染胃癌患者中阳性表达率可达到为 31.81%,N F-κ Bp65在无 HP感染胃癌患者中阳性表达率为20.58%,N F-κ Bp65在癌旁组织中阳性表达率为4.00%,而正常胃黏膜中 N F-κ Bp65均为阴性。有 HP感染和无 HP感染胃癌患者的 N F-κ Bp65表达阳性率有统计学差异 (P＜0.05),且 HP感染组的 N F-κBp65蛋白表达阳性率高于无 HP感染组,提示胃癌患者的N F-κ Bp65蛋白表达与 HP感染存在相关性,即有 HP感染,N F-κ Bp65蛋白的表达会增高。HP感染组、无 HP感染组及对照组(癌旁正常组织)的 NF-κ Bp65蛋白表达阳性率比较有统计学意义 (P ＜0.05),且 HP感染组和无 HP感染组的N F-κ Bp65蛋白的表达均高于对照组 ,提示 N F-κ Bp65蛋白在胃癌组织中的阳性表达率比较高的,且阳性表达随着肿瘤的恶性程度呈现逐渐上升趋势。

3.2 P53基因与胃癌发生的关系

具有“分子警察基因”和“凋亡基因”之称的基因是 P53基因。根据文献报道大约50%的人类肿瘤中缺乏野生型P53,所以免疫组化方法检出的 P53蛋白均属于突变型[14]。应用免疫组化方法可以检测出 P53蛋白的异常表达,同时反映出 P53突变蛋白在核内的积累。最近几年来应用免疫组化方法检测证实 P53蛋白在胃癌组织中有过度的表达,本篇文章采用免疫组化技术检测的100例胃癌组织标本,P53蛋白阳性表达率为52.50%,低于国内国外文献报道中的水平。经过本研究检测到的 P53蛋白阳性反应物全部都为癌变细胞,邻近的间质及相应正常黏膜上皮均未见阳性表达,这一结果与国内国外文献报道相一致。HP感染组、非 HP感染组和对照组P73蛋白表达有统计学意义 (P＜0.05),说明胃癌患者 P73蛋白表达与 HP感染存在相关性,目前,对胃癌患者 P73蛋白表达与 HP感染存在之间的关系研究尚不明确,仍有待于进一步研究。

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