胡椒提取物抑菌活性研究

杨 敏，袁佳依，陈文学

（海南大学食品学院，海南海口 570228）

随着我国居民生活水平的日益提高，人民对天然防腐剂及其他天然食品添加剂需求的不断增加，从而促进了天然食品添加剂的广泛应用[1]。植物类天然防腐剂是指具有一定的防腐抑菌作用的植物或者植物提取物，而从植物中提取有效抑菌成分已经成为研发天然植物型防腐剂的热点之一[2]。当前，植物被认为是化学合成杀菌剂替代品最好的开发资源，有人报道[3]超过1389种植物具有杀菌活性。胡椒自1947年引入中国，目前种植面积超过3万hm2，年总产量过3万t，面积和产量世界排名分别是第6位和第5位[4]。胡椒主要含有胡椒碱、胡椒脂碱、胡椒新碱及挥发油成分。胡椒提取物中含量最大并且活性最高的是胡椒碱。胡椒碱（Piperine）是许多药理活性的主要化学物质，属于桂皮酰胺类生物碱[5-7]，研究表明，胡椒醇提取物对实验用常见食品污染菌有较强的抑制作用，可用于食品防腐保藏[8]。黑胡椒有强烈芳香和刺激性辣味，还具有除臭、防腐和抗氧化作用，在食品中广泛使用[9]。马同锁等[10]通过对姜、大蒜、八角茴香、胡椒、辣椒等13种天然香辛料的研究发现，以辣椒、姜、蒜、胡椒、八角茴香的抑菌作用最为明显。胡椒的乙醇提取物对常见食品污染菌有较强的抑制作用；对来自于口腔中的12种不同属的176个细菌菌株具有较强的抑制作用[11]；胡椒挥发油对动物和植物病菌、腐败菌均有抑制效果[12]；徐燕等[13]对胡椒醇提取的抑菌作用进行了研究，结果表明，胡椒醇提取物对实验用常见食品污染菌有较强的抑制作用。K J Pradhan等[14]研究了青胡椒中的酚类化合物的抑菌作用，发现该物质对食品易腐菌、鼠伤沙门氏菌、葡萄球菌、杆菌和大肠杆菌均有抑制作用。本文通过对胡椒提取物MIC的测定，对进一步研究胡椒抑菌机理和综合开发利用提供一定的指导意义。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

海南黑胡椒、土豆 市售；大肠杆菌E.Coli、枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis、金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus、黑曲霉Aspergillus niger、酵母菌Saccharomycetes 海南大学食品学院实验室；乙醇、石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇 分析纯，天津市富宇精细化工有限公司；NaCl 分析纯，广州化学试剂厂；蛋白胨、牛肉浸膏、营养琼脂粉 生化试剂，广东环凯微生物科技有限公司；苯甲酸钠 食品级，王龙集体有限公司；山梨酸钾 食品级，无锡江大百泰科技有限公司。

SW-CI-IFD洁净工作台 苏州佳宝净化工程设备有限公司；GI540W自动高压蒸汽灭菌锅 致微仪器有限公司；PL3002电子天平 梅特勒托利多仪器有限公司；SPX智能型生化培养箱 宁波江南仪器厂。

1.2 实验方法

1.2.1 胡椒提取物的制备 参照陈文学[15]的提取方法，利用体积分数为80%的乙醇溶液对胡椒粉末进行提取，经真空减压浓缩得到膏状胡椒提取物，置于4℃冰箱保存备用。

1.2.2 不同溶剂萃取物的制备 取胡椒提取物5g，加蒸馏水至约100mL，得到浑浊的悬浮液，转入250mL分液漏斗中，加入100mL石油醚，充分振摇萃取，静置，待溶液完全分层后，放出上层的石油醚萃取液，剩余的水溶液用同样的方法再萃取二次，每次分别加入100、50mL石油醚，合并三次石油醚萃取液，在35～40℃下真空减压回收石油醚，得到石油醚提取物。按相同的方法依次制备氯仿、乙酸乙酯、正丁醇提取物。

1.2.3 配制培养基 按照配制细菌培养基及真菌培养基的方法[16]配制。

1.2.4 活化菌种 接种完成后，酵母菌置于28℃恒温箱中培养48h后拿出，大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌置于37℃恒温箱中培养24h后拿出，黑曲霉置于37℃恒温箱中培养48h后拿出。

1.2.5 菌悬液的制备 采用MPN计数法确定菌悬液浓度，使所用菌悬液浓度保持在105个/mL。

1.2.6 最低抑菌浓度（MIC）的测定 测定各相黑胡椒提取物及常用防腐剂对五种常见植物真菌的最低抑菌浓度（MIC）。将乙醇、氯仿、正丁醇、石油醚、乙酸乙酯的提取物及苯甲酸钠、山梨酸钾的稀释浓度均配制为12.5～800mg/mL。为了保持实验的一致性，把菌悬液按照梯度稀释法稀释到同一浓度梯度105个/mL。在平板中加入2mL提取物溶液，然后加入18mL融化后冷却到45～60℃的琼脂培养基并迅速往复摇动和转圈晃动5～10s，使培养基与提取液充分混合，使最终浓度为1.25～80mg/mL。以无菌水和乙醇作为对照，分别记为CK1和CK2。

待培养基冷却后，用移液枪吸取0.2mL菌液，移入平皿中，均匀涂布。观察各培养皿的菌种生长情况。

2 结果与分析

2.1 菌悬液MPN测定结果

根据1.2.5的方法对菌悬液MPN进行测定，结果见表1。

表1 五种菌悬液的MPN（个/mL）Table 1 The MPN values of five kinds of bacteria levitation liquid

由表1可知，大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、酵母菌及黑曲霉的MPN分别为1.1×107、1.1×106、1.1×107、1.1×107、2.1×107个/mL。

2.2 各培养皿的生长状况及最低抑菌浓度

大肠杆菌在各培养基的生长状况见表2。由表2可知，对于大肠杆菌，不同的具有防腐作用的物质的抑菌效果明显不同。氯仿相对大肠杆菌的抑制效果最好，正丁醇相、石油醚相、乙酸乙酯相对大肠杆菌的抑制效果次之，乙醇相、苯甲酸钠、山梨酸钾对大肠杆菌的抑制效果依次减弱。胡椒的有机溶剂提取物对大肠杆菌的抑制效果优于常用防腐剂。

枯草芽孢杆菌在各培养基的生长情况如表3所示。由表3可知，对于枯草芽孢杆菌，不同的具有防腐作用的物质的抑菌效果明显不同。氯仿相对枯草芽孢杆菌的抑制效果最好，正丁醇相对枯草芽孢杆菌的抑制效果较佳，石油醚相和乙酸乙酯相的抑制效果次之，乙醇相、苯甲酸钠、山梨酸钾对枯草芽孢杆菌的抑制效果依次减弱。胡椒的有机溶剂提取物对枯草芽孢杆菌的抑制效果均优于常用防腐剂。

表2 大肠杆菌在各培养皿的生长状况Table 2 The growth of E.coli in the culture dishes

表3 枯草芽孢杆菌在各培养皿的生长状况Table 3 The growth of Bacillus subtilis in the culture dishes

金黄色葡萄球菌各培养基的生长情况如表4所示。由表4可知，对于金黄色葡萄球菌，不同的具有防腐作用的物质的抑菌效果明显不同。氯仿相对金黄色葡萄球菌的抑制效果最好，正丁醇相、石油醚相的抑制效果较佳，乙酸乙酯相对金黄色葡萄球菌的抑制效果次之，苯甲酸钠、乙醇相、山梨酸钾对金黄色葡萄球菌的抑制效果依次减弱。除乙醇提取物外，胡椒的有机溶剂提取物对金黄色葡萄球菌的抑制效果均优于常用防腐剂。

酵母菌在各培养基中的生长情况如表5所示。由表5可知，对于酵母菌，不同的具有防腐作用的物质的抑菌效果明显不同。氯仿相对酵母菌的抑制效果最好，正丁醇相对酵母菌的抑制效果较佳，石油醚相、乙酸乙酯相、苯甲酸钠的抑制效果次之，而乙醇相、山梨酸钾对酵母菌的抑制效果依次减弱。除乙醇相外，胡椒的有机溶剂提取物对酵母菌的抑制效果均优于常用防腐剂。

黑曲霉在各培养基中的生长情况如表6所示。由表6可知，对于黑曲霉，不同的具有防腐作用的物质的抑菌效果明显不同。氯仿相对黑曲霉的抑制效果最好，正丁醇相对黑曲霉的抑制效果次之，石油醚相、乙酸乙酯相、苯甲酸钠、山梨酸钾对黑曲霉的抑制效果相似，乙醇相对黑曲霉的抑制效果最弱。除乙醇相外，胡椒的有机溶剂提取物对酵母菌的抑制效果均优于常用防腐剂。

由表2～表6可知，各相提取物对这四种菌的最低抑菌浓度如表7所示。

由表7可知，对于这五种常见菌，具有防腐作用的不同物质的抑菌效果明显不同。从最低抑菌浓度可以得出抑菌效果：对大肠杆菌的抑菌效果强弱顺序依次为：氯仿相＞正丁醇相=石油醚相=乙酸乙酯相＞乙醇相＞苯甲酸钠＞山梨酸钾；对金黄色葡萄球菌的抑菌效果强弱顺序依次为：氯仿相＞正丁醇相=石油醚相=乙酸乙酯相＞苯甲酸钠＞乙醇相＞山梨酸钾；对枯草芽孢杆菌的抑菌效果强弱顺序依次为：氯仿相＞正丁醇相＞石油醚相=乙酸乙酯相＞乙醇相=苯甲酸钠＞山梨酸钾；对酵母菌的抑菌效果强弱顺序依次为：氯仿相＞正丁醇相＞石油醚相=乙酸乙酯相=苯甲酸钠＞乙醇相＞山梨酸钾；而对黑曲霉的抑菌效果强弱顺序依次为：氯仿相＞正丁醇相＞石油醚相=乙酸乙酯相=苯甲酸钠=山梨酸钾＞乙醇相。可能的原因有：这五种有机溶剂对黑胡椒中抑菌活性物质的提取率不同；不同有机溶剂提取出的极性物质不同，从而有不同的抑菌效果。

表4 金黄色葡萄球菌在各培养皿的生长状况Table 4 The growth of Staphylococcus aureus in the culture dishes

表5 酵母菌在各培养皿的生长状况Table 5 The growth of yeast in the culture dishes

表6 黑曲霉在各培养皿的生长状况Table 6 The growth of Aspergillus niger in the culture dishes

表7 各相提取物对四种菌的MICTable 7 The MICs of four kinds of bacteria with every phase

3 结论

3.1 五种胡椒提取物和2种防腐剂对五种菌都有一定的抑菌作用，其中氯仿相的抑菌效果最好，其次是正丁醇相，石油醚相和乙酸乙酯相，而乙醇相、苯甲酸钠、山梨酸钾的抑菌效果较弱。胡椒提取物对5种供试菌均有抑制作用，可见胡椒提取物具有广谱抑菌性。

3.2 从五种菌悬液的MPN可知：相同条件下，黑曲霉的生长最旺盛，大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、酵母菌的生长能力相似，而枯草芽孢杆菌的生长能力相对较弱。通过对G+、G-、酵母菌和黑曲霉的细胞结构及成分分析，初步推测，胡椒提取物的抑菌效果和菌体的细胞壁成分有较大关系。在胡椒提取物的作用下，细胞壁的通透性可能发生变化，使胡椒提取物进入细胞内，达到抑菌的目的。

3.3 除乙醇相外，胡椒的有机溶剂提取物的抑菌效果均优于常用防腐剂。因此，胡椒提取物作为天然防腐剂成为可能，但是由于提取物成分复杂，对其主要作用的成分需要进一步探究。

[1]王丽，张毓，陈翠岚.我国食品防腐剂的应用及发展趋势[J].食品安全质量检测学报，2011（2）：83-87.

[2]于智峰，赵立庆，郑君君，等.天然防腐剂在肉制品中的应用[J].中国调味品，2012，37（3）：12-21.

[3]王大鹏，王进忠，孙淑玲.植物源农用杀菌活性物质研究与应用前景[J].北京农学院学报，2001，16（3）：75-79.

[4]龙宇宙.热带特色香辛饮料作物农产品加工与利用[M].海口：海南出版社，2007：63-113.

[5]韦琨，窦德强，装玉萍，等.胡椒的化学成分、药理作用及与卡瓦胡椒的对比[J].中国中药杂志，2002，27（5）：328-332.

[6]刘红，赵建平，谭乐和.胡椒碱的研究进展[J].中国调味品，2008（10）：33-37.

[7]刘屏，婧侠，于腾飞.胡椒碱药理作用的研究进展[J].中国药物应用与监测，2007（3）：7-9.

[8]苗明山.食疗中药药物学[M].北京：科学出版社，2001.

[9]凌关庭.天然食品添加剂[M].北京：化学工业出版社，2000：330-331.

[10]马同锁，张红兵，刘月英，等.十三种天然香辛料的抑菌作用研究[J].山西食品工业，2005（1）：18-16.

[11]Chaudhry N M，Tariq P.Bactericidal activity of black pepper，bay leaf，aniseed and coriander against oral isolates[J].Pak J Pharm，2006，19（3）：214-218.

[12]Dorman H J，Deans S G.Antimicrobial agents from plants：antibacterial activity of plant volatile oils[J].J Appl Microbiol，2000，88（2）：308-316.

[13]徐燕，刘德清.胡椒中天然防腐剂的提取方法及其抑菌作用研究[J].中国调味品，2007（7）：57-59.

[14]K J Pradhan，P S Variyar，J R Bandekar.Antimicrobial Activity of Novel Phenolic Compounds from Green Pepper（Piper nigrum L.）[J].Lebensm-Wiss u-Technol，1999（32）：121-123.

[15]陈文学，胡月英，葛畅，等.黑胡椒抑菌活性物质提取工艺优化[J].食品工业科技，2010（11）：279-282.

[16]黄国霞，李军生，阎柳娟.几种中药提取物的抑菌作用及机理研究[J].时珍国医国药，2011，22（2）：425-426.