生产纯净水废水培养螺旋藻技术

赵文越，王雪青，何晓萍

（天津市食品与生物技术重点实验室天津商业大学生物技术与食品科学学院，天津 300134）

螺旋藻[1-2]是地球上最古老的原核光合生物，迄今已有35亿年的生命史，是目前发现的营养最丰富、最均衡的天然绿色食品，有“微型绿色营养库”之称。然而，螺旋藻是一种淡水藻，需要大量的淡水对其培养，而日益短缺的淡水资源限制其生产规模。

利用废水养殖螺旋藻不仅降低其生产成本，更重要的是对环境友好。20世纪70年代以来，国外就有利用沼气池废水、城市废水、二级处理厂废水以及缫丝、印染、制药、酿造、制糖、制革等工业有机废水养殖螺旋藻等微藻并使废水得以净化的报道[3-6]。国内也有关于利用糖蜜、酒精、啤酒废液对螺旋藻实施培养的研究。废水来源不同，重金属等有毒物质的含量也不同。生产食品级螺旋藻只能采用无毒或低毒废水，而对于饲料或工业级螺旋藻可适当放宽要。

近年纯净水产量急剧上升，伴其而生的废水也急剧增加。这些废水倒入河流，不仅造成浪费，而且改变河流的盐度，影响环境。纯净水生产废水含有一定量的无机物（C、N、P源）和各种金属离子，这些无机物为螺旋藻的生长提供基本营养条件。经过适当调节，就能利用这些废水生产高价值的螺旋藻。

研究不同营养条件下，利用纯净水生产废水培养螺旋藻，旨在为利用纯净水生产废水培养螺旋藻提供有益的参考数据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 藻种

钝顶螺旋藻869藻株:天津商业大学生物工程专业实验室获得。

1.1.2 废水

纯净水的生产废水：天津商业大学品佳水中心提供。

1.2 主要实验仪器

DDSJ-308A型台式电导率仪、7230G型分光光度计：上海精密科学仪器有限公司；FD-2型密封式恒温可调电加热器：金坛市瑞华仪器有限公司；SN510C型高压蒸汽灭菌锅：重庆雅马拓科技有限公司；HPG-280BX光照培养箱：北京中科浩宇科技发展有限公司；DG-202-3型电热恒温干燥箱：天津市天宇实验仪器有限公司。

1.3 测定方法

1.3.1 pH的测定

精密pH试纸法。

1.3.2 电导率的测定

电导率仪法。

1.3.3 藻的培养与生物量的测定

取一瓶对数生长期的钝顶螺旋藻培养液，摇匀，按照10%体积比的接种量接入废水培养基与AB培养基中，放在HPG-280BX光照培养箱培养。培养条件：光照温度为24.8℃，光照强度为4 000 lx，光暗周期为12 h∶12 h。每天观察藻种生长状态，560 nm处测定培养液OD值。培养不同时间的藻液，取一定体积，抽滤、用蒸馏水冲洗3次，把藻泥与已称重量的滤纸取出一起放入已烘干至恒重的称量瓶中，置于80℃烘箱加热至恒重，称重，求得光密度与干重的关系。

2 结果与分析

2.1 螺旋藻的吸光度值与干重的关系

判断螺旋藻在不同的培养条件下生长的状况，跟踪测定其生物量是常用的方法。生物量测定有多种方法，如细胞干重法、光密度（OD）法等，从不同侧面反映了相应微藻的生长状况，前者精确，费时；后者便捷。因此，为了快速、方便的实现两种指标的互换，按照1.3.3方法操作，动态检测了螺旋藻培养液的吸光度值与干重的关系[7-8]，见图1。

图1 光密度与细胞干重的关系Fig.1 The relationship between the optical density and cell dry weight

由图1可见，细胞干重与螺旋藻培养液OD560nm之间存在很好的线性关系，回归可得：Y=10.664X+0.002 4。式中：Y为吸光度值；X为细胞干重值。因此，可以通过测定培养液的OD可以得到不同培养液的藻的生物量，为后续的研究工作提供方便。

2.2 采用废水培养螺旋藻初探

2.2.1 废水及AB培养基的一些理化指标

溶液中的盐度、pH是培养螺旋藻的重要指标。可以直接采用电导仪和pH计测定溶液用电导率和pH。废水和AB培养基的理化参数见表1。

表1 废水及AB培养基的一些理化指标Table 1 Some physical and chemical indicators of the wastewater and AB medium

从表1可知，废水中的盐的浓度和pH与AB培养基相差较大。

2.2.2 纯净水生产废水直接培养螺旋藻初步研究

将螺旋藻按照10%（体积分数）的接种量接种于灭菌废水中，观察不同时间的培养液的颜色和吸光度值。结果见表2和表3。

由表2和表3可知，直接用废水培养螺旋藻，螺旋藻不能生长，而且很快死亡，因此用废水直接培养螺旋藻是不可行的，必须改变废水的营养成分。

表2 废水中钝顶螺旋藻869的生长状态Table 2 Spirulina platensis 869 growth state cultured in the wastewater

表3 培养液中钝顶螺旋藻869的生长情况Table 3 Spirulina platensis 869 growth situation in the wastewater

2.3 螺旋藻在单因素改良废水中的生长状态研究

2.3.1 添加VB1、VB12对螺旋藻生长的影响

VB1、VB12等有机物有促进生物生长繁殖的作用。有研究显示VB1、VB12混合液对海洋原甲藻、赤潮生物的生长有显著的促进作用不同的藻类对于VB1、VB12有一定的相关性[9-10]。因此本实验首先探究通过添加VB1、VB12对废水培养基培养螺旋藻生长情况的。以AB培养基为参考，1 L废水加入1 mL VB12液，使其终浓度为0.15 μg/L为培养基，结果如表4，表5所示。

表4 废水中只添加VB12钝顶螺旋藻869的生长状态Table 4 Spirulina platensis 869 growth state cultured in the wastewater modified with vitamin B12

表5 添加VB12后培养液中钝顶螺旋藻869的生长情况Table 5 Spirulina platensis 869 growth situation in the wastewater modified with vitamin B12

通过实验可知只加入VB12来调节废水培养基的营养成分，结果并没有得到改善。由这个实验可以推测废水中的无机盐含量应该是影响钝顶螺旋藻生长的主要原因。

2.3.2 添加K2HPO4对螺旋藻生长的影响

从废水的理化参数表1可知，废水与AB培养基在电导率上有较大的差异。因此，向废水中加入一些可溶性的无机盐，提高废水溶液的电导率来研究螺旋藻生长情况。无机盐有多种，包括N、P、S、K等。鲍亦璐等研究表明，螺旋藻培养过程中营养源消耗量为：N源（NO3-）、P 源（HPO42-）、S 源（SO42-），而 Cl-基本不消耗[11-12]。由凯氏定氮测定AB培养基和废水中的总氮含量，显示废水中的氮含量要高于AB培养基中的（结果未显示），因此不用再向废水中添加氮源。

不添加或只添加VB12，培养螺旋藻都有藻体发黄的现象。有研究表明当磷源不足时会影响螺旋藻叶绿体的含量，出现发黄的症状，所以磷源应该是废水中缺乏的一种营养成分[13]。向废水中加入不同浓度的K2HPO4，对螺旋藻生长状态和生物量的影响结果如表6，图2所示。

表6 废水中只添加K2HPO4钝顶螺旋藻869的生长状态Table 6 Spirulina platensis 869 growth state cultured in the wastewater modified with K2HPO4

图2 添加K2HPO4后各种培养液中钝顶螺旋藻869的生长曲线图Fig.2 Spirulina platensis 869 growth curves cultured in the wastewater modified with K2HPO4

由表6和图2可以看到，通过加入K2HPO4之后，钝顶螺旋藻的生长状况得到了改善。当K2HPO4的浓度小于0.5 g/L时，藻生长量浓度增加不大，藻液呈黄绿色，表现出缺乏磷源。磷源浓度为0.5 g/L时，藻体生长正常，藻呈绿色，藻浓度一直呈现上升趋势。磷源浓度达到0.6 g/L时，对藻生长并没有起到有效地促进作用，后期藻浓度略低于前者，从K2HPO4的添加量和藻生长情况综合考虑，选择0.5 g/L添加量作为废水培养基的磷源添加浓度。

但实验结果显示，尽管加入了磷源，钝顶螺旋藻的生长状况改善，与AB培养基中的螺旋藻相比较，藻体生长还是大幅落后。

2.3.3 添加NaHCO3对螺旋藻生长的影响

由表1显示，废水与AB培养基差异比较大的理化指标之一是pH。NaHCO3除了可以调整废水中的pH作用之外，还可以向螺旋藻提供C源。在螺旋藻的培养溶液中，CO2含量是非常低的，HCO3-则占了绝大部分，外源无机碳主要利用形式是HCO3-。同时NaHCO3可以起到保持培养基较强的碱性和pH缓冲作用，有利于防止其他藻类的污染[14-15]，向已添加0.5 g/L K2HPO4的废水中分别加入不同浓度的NaHCO3进行对比实验，选择出最适合的条件。结果如表7所示，并且由实验数据绘制加入不同浓度的K2HPO4的各藻液的生长曲线见图3。

表7 废水中只添加NaHCO3钝顶螺旋藻869的生长状态Table 7 Spirulina platensis 869 growth state cultured in the wastewater modified with NaHCO3

图3 添加NaHCO3各个培养液中钝顶螺旋藻869的生长曲线图Fig.3 Spirulina platensis 869 growth curves cultured in the wastewater modified with NaHCO3

由此实验的结果可知在加入了NaHCO3之后，藻体的生长情况的得到了较好改善，在培养周期内，藻体没有出现发黄及死亡的现象。对图3以及表7进行分析，添加不同浓度的NaHCO3的培养基对照组，藻体生长良好。当NaHCO3浓度小于8.0 g/L时，螺旋藻的生长迟缓，当NaHCO3浓度达到8.0 g/L及以上时，废水的pH增大至9以上，但是各种添加浓度之间，螺旋藻的生长状态差异不显著。随着培养时间的延长，生物量呈稳步增值趋势，第7天达到最大值。综合考虑，选择8.0 g/L NaHCO3添加量作为废水培养基的碳源浓度。但是与同时培养的AB培养液相比，螺旋藻的生长状况还是比较缓慢。

2.4 螺旋藻在综合改良废水中的生长状态研究

虽然废水经过添加C、P无机盐后，螺旋藻可以生长，但与AB培养基比较，还是有较大的差距。为了使螺旋藻更好的生长，在已经添加了磷源和碳源的基础上，再加入VB12，使其终浓度为0.15 μg/L，作为改良废水（1），另外，在改良废水（1）的基础上，再按照 AB 培养基的营养添加组分和浓度，添加As液和PIV液，作为废水（2），观察培养螺旋藻的生长情况。

表8 钝顶螺旋藻869在改良废水（1）和（2）的生长状态Table 8 Spirulina platensis 869 growth state cultured in the improved wastewater（1）and（2）

图4 钝顶螺旋藻869在改良废水（1）和（2）的生长曲线Fig.4 Spirulina platensis 869 growth curves cultured in the improved wastewater（1）and（2）

由实验数据分析，在添加了维生素液以及As液和PIV液之后，两种废水培养基与AB培养基中的螺旋藻相比较，它们的生长情况比较一致。在生长的前期，只添加了维生素液的培养基中的螺旋藻生长较快，这可能钝顶螺旋藻能够比较快的适应它的营养环境，而对于另外两种培养基则需要相对长一点的适应期。到了第4天，废水培养基（2）中的藻体生长很快，AB培养基中的螺旋藻显然也加快了生长，这两者的生长情况比较一致，藻液浓度增长的趋势也很平稳。到了第7天，废水培养基（2）中的藻浓度达到最大值，吸光度为1.886。这一实验表明了废水再经过了一系列的调节后，培养螺旋藻的能力可以得到大幅度的提高。

3 结论

每升纯净水生产废水中添加0.5 g K2HPO4，8 g NaHCO3、0.15 μg VB12，再按照 AB 培养基配方添加 As液和PIV液，在光强强度4 000 lx、温度24.8℃，光暗周期为12 h∶12 h的条件下培养螺旋藻7 d，达到生物量1.766 g（DW）/L，与螺旋藻在传统AB培养基和相同的培养条件下的生物量相当。

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