双试剂速率法测定二胺氧化酶活性的研究

胡进访，吴 雁，王白石，王 旭

(1.天津市泰达医院检验科，天津 300457;2.天津医科大学医学检验学院，天津 300203)

二胺氧化酶(diamine oxidase，DAO，E.C.1.4.3.6)是人和哺乳动物小肠黏膜绒毛和胎盘绒毛中具有高度活性的细胞内酶，在二胺(组胺、腐胺和尸胺)代谢中起催化作用，其与肠黏膜细胞核酸和蛋白质合成密切相关[1]，在分裂细胞中高度表达。血DAO活性的变化是反映小肠黏膜结构和功能状况的较理想指标[2]。我们根据 Kirsten 等[3]、Lorenz等[4]和 Hosoda等[5]介绍的方法，建立了双试剂连续监测法测定血中DAO活性。

材料和方法

一、仪器与试剂

岛津UV-VIS2450型紫外-可见吸收光谱仪，HITACHI 7600-020全自动生化分析仪，BECKMAN CX7全自动生化分析仪。1，4-丁二胺(腐胺)、DAO、还原型辅酶Ⅰ(nicotinamide adenine dinucleotide，NADH)、二磷酸腺苷(adenosine diphosphate，ADP)、乳酸脱氢酶(lactic dehydrogenase，LDH)、谷氨酸脱氢酶 (glutamic acid dehydrogenase，GLDH)、α-酮戊二酸、血红蛋白、胆红素均购自美国Sigma公司;乙二胺四乙酸二钠购自Genview公司;医用脂肪乳及其他试剂均为国产试剂。

二、试剂配制

1.100 mmol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)缓冲液 精确称取12.153 g Tris，加入1.0 mL 5 mmol/L乙二胺四乙酸二钠，用1.0 mol/L HCl调pH 值至8.0，定容至1000 mL。

2.试剂Ⅰ 按各自相对分子质量和酶活性取量，用 Tris-HCl缓冲液配制 0.3 mmol/L ADP、1000 U/L LDH、3000 U/L GLDH、5 mmol/L乙二胺四乙酸、10 mmol/L α-酮戊二酸溶液。

3.试剂Ⅱ 准确称取0.2668 g 1，4-丁二胺溶于 1000 mL Tris-HCI缓冲液中，浓度为3.2 mmol/L;0.25 mmol/L NADH。

三、研究对象

选择2006年1月至2009年12月在天津市第四医院烧伤病房住院的严重烧伤患者30例。所有患者烧伤早期均接受正规休克复苏治疗，休克期度过平稳，手术及创面换药按常规进行，于伤后第2天抽取静脉血，分离血清于－80℃冷冻保存备用。

从健康体检人群中选取临床诊断基本正常，肝功能、肾功能、血脂均正常，无肠道疾病的健康体检者150名，年龄18～55岁，男、女各75名，女性均为非妊娠期。采集静脉血，分离血清，－80℃冷冻保存备用。

四、方法

1.DAO的测定原理 利用DAO催化1，4-丁二胺产生H2O2和NH3，NADH、NH3和α-酮戊二酸在GLDH作用下，生成NAD+和谷氨酸，NADH在340 nm处有特异吸收峰，其被氧化的速率与血清DAO活性呈正比，测定NADH下降速率，即可测出DAO活性。反应方程式:1，4-丁二胺+O2+H2OR-CHO+NH3+H2O2;NH3+α-酮戊二酸+NADH+谷氨酸+NAD++H2O。被检样本与试剂Ⅰ作用一定时间后，可将内源性1，4-丁二胺和NH3消耗掉，再加入试剂Ⅱ测定。此设计方法排除了内源性干扰，保证了DAO测定的准确性。

2.吸收光谱范围测定 试剂Ⅰ和试剂Ⅱ按4∶1混合后，加入30 U/L DAO标准液于37℃反应3～5 min，用岛津UV-VIS2450紫外-可见吸收光谱仪进行波长扫描，测定吸收光谱。

3.最佳检测时间的确定 试剂Ⅰ和试剂Ⅱ按4∶1混合后，加入30 U/L DAO标准液于37℃反应，用岛津UV-VIS2450紫外-可见吸收光谱仪检测0～600 s的吸光度(A)值变化率，找出A值稳定变化时间范围，即为最佳检测时间。

4.最适Tris-HCl缓冲液浓度与pH值选择对不同浓度的Tris-HCl缓冲液(分别为50、100、200、500 mmol/L)和 pH 值(分别为 7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5)与高浓度 DAO 临床样本进行测定，观察DAO在不同浓度的缓冲液和pH条件下的活性变化，找出最佳缓冲液浓度和pH值。

5.最佳底物浓度选择 用100 mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH 值8.0)制成不同浓度1，4-丁二胺溶液(0～8.0 mmol/L)，对临床高值血清中DAO进行测定。按双倒数做图法求得DAO的Km值，最佳底物浓度为Km值的10～20倍。

五、方法学评价

1.线性范围 取DAO分别配制成2.5、5.0、10、20、40、80、100、160、240 U/L，在全自动生化分析仪上进行测定，绘制标准曲线，得出线性范围。

2.精密度试验 选用10、30、50 U/L DAO标准液，1 d内连续测定20次，计算批内精密度;每天不同浓度各测2次，连续测定20 d，取其均值计算批间精密度。

3.回收试验 取DAO活性为10和30 U/L的临床血样本0.9 mL，各加入0.1 mL蒸馏水作为基础样本Ⅰ和Ⅱ;加入0.1 mL 100 U/L DAO标准品混合作为回收样本Ⅰ和Ⅱ，测定其实测值与理论值的差异，计算回收率。

4.干扰试验 按干扰物体积与血清样本体积比为1∶9向临床高值混合血清(24 U/L)中加入不同浓度的干扰物，使其样本中干扰物终浓度分别为胆红素:50、100、150、200 μmol/L;血红蛋白:0.5、1、2、3、4、5 g/L;脂肪乳:2、3、4、5、6 g/L;NH4+:40、60、80、100、150 μmol/L;单胺氧化酶(monoamine oxidase，MAO):40、60、80、100、120、140 U/L。每份样本重复测定2次，取其均值与理论值做比较，其干扰变异系数(CV)＜5%为无干扰。

5.试剂稳定性试验 将试剂Ⅰ和Ⅱ分别置于HITACHI 7600-020全自动生化分析仪和BECKMAN CX7全自动生化分析仪试剂仓中，连续观察4周10和30 U/L两水平DAO标准液测量值的变化。同时在BECKMAN CX7全自动生化分析仪上进行试剂空白监测，以试剂空白＜0.5为试剂失效。

6.样本稳定性 将3例血液样本分别放置于室温、4℃和－80℃保存，观察不同储藏温度对样本中DAO稳定性的影响。同时还观察了反复冻融对3个不同浓度DAO的影响。

7.诊断准确度 选取30份烧伤后出现胃肠道黏膜屏障功能障碍或衰竭的烧伤患者样本和30份正常对照者样本，用本法测定血清DAO活性，采用受试者工作特征(receiver operating charateristic，ROC)曲线评价诊断准确度。

8.参考区间 测定150名健康体检者DAO活性浓度，按95%可信区间确立参考区间。

六、统计学方法

结 果

一、方法建立

1.光谱扫描结果 DAO试验反应的特异吸收峰值与反应原理中NADH的特异吸收峰值一致，均为340 nm。因此本法检测波长为340 nm，副波长选择405～410 nm以排除试验干扰。见图1。

2.最佳检测时间的确定 图2显示200～300 s曲线近似水平，△A变化率稳定，故选为最佳检测时间。

图1 DAO试验反应波长扫描

图2 DAO试验反应△A变化率-经时曲线

3.最佳缓冲液浓度与pH值选择 高浓度DAO测定值在缓冲液浓度为100 mmol/L、pH值8.0时最大。因此以100 mmol/L、pH值8.0为最佳缓冲液浓度及pH值。结果见表1。

表1 不同缓冲液浓度与pH值条件下测定结果(U/L)

4.最佳底物浓度选择 根据实测结果做图可看出当底物浓度＞3.2 mmol/L时A值变化不大，反应几乎为最大速度，说明反应已达零级反应。临床样本实测底物最佳浓度为3.2 mmol/L。根据Mjehaelis-Menten方程做双倒数曲线，计算求得Km=0.15。最佳底物浓度应为Km的10～20倍，与临床样本实测底物最佳浓度相近似。见图3。

图3 底物浓度与酶促反应

二、方法学评价

1.线性范围 本法线性范围为0～100 U/L。见图4。

图4 DAO测定的线性范围

2.精密度试验 高值(50 U/L)、中值(30 U/L)及低值(10 U/L)3个水平的批内和批间精密度均＜5%，本法重复性良好。见表2。

3.回收试验 2个水平的回收率分别为98.0%、95.8%，说明本法准确度较高。见表3。

表2 精密度试验结果

表3 回收试验结果

4.干扰试验 胆红素 ＜150 μmol/L、血红蛋白 ＜4 g/L、脂肪乳 ＜4 g/L、NH4+＜ 60 μmol/L、MAO＜120 U/L时对本法无明显干扰。见表4。

表4 干扰试验结果

5.试剂稳定性 检测结果以CV＜10%为限，试剂在BECKMAN CX7全自动生化分析仪上可稳定保存3周，在日立HITACHI 7600-020全自动生化分析仪上可稳定保存2周;以试剂空白A值＞0.5A为限，试剂可在BECKMAN CX7全自动生化分析仪上可保存3周。

6.样本稳定性 样本置4℃可保存1周，－80℃可保存6个月，反复冻融对反应结果有影响。

7.诊断准确度 ROC曲线下面积为0.960(在非参数假设下标准误=0.022;在零假设下渐进Sig=0.000;渐近 95% 可信区间:0.913～1.000)。表明本法的诊断准确度良好。见图5。

图5 ROC曲线分析

8.参考区间 150名健康对照者血清DAO活性为(3.90±2.96)U/L，按 95%可信区间其诊断参考区间为0～9.7 U/L。

讨 论

DAO是一种有脱胺作用的细胞内氧化酶，主要存在于哺乳动物小肠黏膜、胎盘绒毛和肾组织中，其中95%以上存在于小肠黏膜或绒毛上皮细胞，其分解代谢组胺等多胺物质与细胞核酸和蛋白合成密切相关，具有高度活性[1]。DAO对1，4-丁二胺和戊二胺具有专属特异催化作用，MAO对其几乎无催化作用，所以反应催化底物选用1，4-丁二胺。NADH、NH3和α-酮戊二酸在 GLDH催化下产生NAD+的反应，已在其他成熟生化反应体系中应用，如尿素检测，所以反应监测指示物选用NADH。本研究用双试剂连续监测法测定DAO，能消除内源性NH3和1，4-丁二胺的干扰，提高了对溶血、黄疸、脂血等样本的抗干扰能力，增强了试剂在机稳定性，优于单试剂法、终点法和酶联免疫吸附试验。本法检测DAO可直接反映酶的催化活性，而非酶的抗原表位含量，在反映酶的催化功能方面优于放射同位素标记测定法、荧光法、酶联免疫吸附试验等免疫学检测法。

方法学评价显示本方法准确度、精密度、线性良好，抗干扰能力强，但易受样本中甘油三酯的影响，故样本应避免脂血。本研究通过观察试剂空白值和标准品测定值的变化联合评价试剂稳定性，分析结果得出影响试剂有效性的主要因素为试剂中NADH的稳定性。为使试剂更稳定和易于保存，配制试剂时应加入EDTA和酶稳定剂。另外，某些重金属离子和硫基化合物皆能抑制DAO[7]，故配制试剂时应注意排除该类物质。试剂在不同仪器上的稳定性有差异，这与仪器的试剂在机贮存温度、制冷方式及试剂容器取样孔的大小相关。本法适用于全自动生化仪，可对单个样本进行实时检测，为急症和重症患者提供准确的临床报告。不同方法所测得酶含量和酶活性有差异，应建立自己实验室的参考区间，以供临床使用。

目前临床用于肠道检查的内窥镜和放射显影技术，只能观察到肠道及其黏膜大体结构变化，而血清DAO检测在细胞水平层面上，可无创伤性地反映肠黏膜结构和功能的损伤、修复情况。血清DAO活性在各种原因导致的肠黏膜损伤、妊娠早期是否正常和胎儿成熟度监测均有临床意义。有研究显示组织或体液中DAO活性升高还见于某些恶性肿瘤[6]，但恶性肿瘤患者血中DAO的检测尚缺乏报道。本法测定DAO适于临床推广。由于本研究病种和病例数有限，对DAO与临床其他疾病的关系有待进一步观察和研究。

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